VEGF诱导内皮细胞MAMs形成
验证VEGF是否增加内皮细胞中ER-线粒体接触和MAM相关蛋白表达。
用VEGF（30 ng/mL）处理HUVECs不同时间，通过TEM和共聚焦显微镜分析ER-线粒体共定位，Western blot检测MAM相关蛋白（IP3R1、IP3R2、MFN2、FUNDC1）。
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FUNDC1依赖的线粒体相关内质网膜参与血管生成和新生血管形成
FUNDC1-dependent mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes are involved in angiogenesis and neoangiogenesis.
实验完整度
高包含体外内皮细胞模型、内皮细胞特异性敲除小鼠模型及肿瘤模型，并有功能验证与Ca2+/SRF/VEGFR2机制验证
主要模型
人脐静脉内皮细胞（HUVECs） 内皮细胞特异性FUNDC1敲除小鼠（FUNDC1f/YCdh5+） Lewis肺癌（LLC）皮下移植瘤模型 小鼠后肢缺血模型
重点核对
VEGF处理HUVECs的时间梯度（0、15、60、180 min，30 ng/mL） FUNDC1 siRNA转染HUVECs 24 h及Ad-Linker感染24 h 内皮细胞特异性FUNDC1敲除小鼠（FUNDC1f/YCdh5+）的敲除效率验证 Matrigel plug中VEGF（100 ng/mL）、FGF2（250 ng/mL）和heparin（0.0025 Unit/mL）的配比及植入10天 抑制肽（peptide-1/2）体外20 μM处理24 h、体内10 mg/kg/3天静脉注射
摘要
含FUN14结构域蛋白1（FUNDC1）是一种线粒体外膜整合蛋白，介导线粒体相关内质网膜（MAMs）的形成。本研究旨在确定FUNDC1介导的MAMs在体外和体内血管生成中的作用。在培养的内皮细胞中，VEGF显著增加MAMs的形成和MAM相关蛋白（包括FUNDC1）的表达。内皮细胞特异性敲除FUNDC1会破坏内皮细胞中MAM的形成，降低VEGFR2表达，并在体外和体内减少管形成、球体发芽和功能性血管形成。相反，使用MAM连接蛋白增加MAM形成可模拟VEGF的效应并促进内皮血管生成。机制上，MAMs形成增加导致胞质Ca2+水平升高，促进血清反应因子（SRF）磷酸化并增强SRF与VEGFR2启动子的结合，导致VEGFR2产生增加，进而促进血管生成。此外，用细胞穿透性抑制肽阻断FUNDC1相关的MAM形成可显著抑制下游血管生成基因的表达并抑制肿瘤血管生成。我们得出结论：通过沉默FUNDC1减少MAMs形成可通过降低VEGFR2表达抑制血管生成，靶向FUNDC1依赖的MAMs可能是治疗以血管生成缺陷为特征的人类疾病的有前景的方法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- FUNDC1介导的线粒体相关内质网膜（MAMs）是否参与血管生成，以及其分子机制如何。
- 核心机制
- FUNDC1依赖的MAMs通过维持胞质Ca2+水平，促进SRF在Ser103位点磷酸化并增强SRF与VEGFR2启动子结合，从而上调VEGFR2表达，促进血管生成。
- 主要证据
- 在HUVECs中，VEGF增加MAMs形成及MAM相关蛋白；FUNDC1缺失降低VEGFR2表达和管形成/球体发芽，而VEGFR2过表达可逆转；MAM连接蛋白增加MAMs促进血管生成；内皮细胞特异性FUNDC1敲除小鼠在视网膜、Matrigel plug、后肢缺血和LLC肿瘤模型中均显示血管生成减少。
- 研究意义
- 靶向FUNDC1依赖的MAMs可能成为治疗血管生成缺陷相关人类疾病的有前景的方法。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
FUNDC1缺失破坏MAMs并抑制血管生成
验证FUNDC1缺失对MAMs形成及体外血管生成的影响。
HUVECs转染FUNDC1 siRNA 24 h，检测ER-线粒体共定位、管形成和球体发芽实验。
内皮细胞特异性FUNDC1敲除小鼠体内血管生成验证
在体内验证FUNDC1缺失对血管生成的影响。
使用FUNDC1f/YCdh5+小鼠，进行视网膜血管分析、Matrigel plug实验、后肢缺血模型和LLC肿瘤模型。
MAMs过形成促进血管生成
验证增加MAMs形成是否促进血管生成。
用Ad-Linker或FUNDC1过表达增加HUVECs中MAMs形成，进行管形成、球体发芽实验；体内通过腺病毒注射进行Matrigel plug、后肢缺血和视网膜血管分析。
VEGFR2介导MAMs的促血管生成效应
验证VEGFR2是否介导MAMs对血管生成的作用。
在FUNDC1缺失的HUVECs中过表达VEGFR2，检测球体发芽；在FUNDC1f/YCdh5+小鼠中静脉注射VEGFR2腺病毒，进行Matrigel plug和LLC肿瘤模型。
Ca2+/SRF调控VEGFR2转录
验证FUNDC1相关MAMs是否通过Ca2+/SRF调控VEGFR2转录。
使用放线菌素D检测mRNA稳定性，构建VEGFR2启动子截短体和突变体进行荧光素酶报告实验，ChIP检测SRF结合，Western blot检测pSRF，使用BAPTA-AM降低Ca2+，SRF siRNA敲低SRF。
抑制肽阻断FUNDC1-IP3R1相互作用并抑制血管生成
验证靶向FUNDC1-IP3R1相互作用的抑制肽对血管生成的治疗效果。
设计peptide-1和peptide-2，在HUVECs中检测Ca2+、SRF磷酸化、VEGFR2表达和球体发芽；在Matrigel plug和LLC肿瘤模型中检测血管生成。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养与处理 | 血管内皮生长因子A165 | Sigma-Aldrich | V5765 |
| 基因敲低 | FUNDC1小干扰RNA | Santa Cruz Biotechnology | sc-36563 |
| IP3R1小干扰RNA | Santa Cruz Biotechnology | sc-91118 | |
| VEGFR2小干扰RNA | Santa Cruz Biotechnology | sc-42475 | |
| SRF小干扰RNA | Santa Cruz Biotechnology | sc-29318 | |
| Western blot | 抗CD31抗体 | BD Pharmingen | 550274 |
| 抗CD31抗体 | Cell Signaling Technology | 77699 | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47778 | |
| 抗GAPDH抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-137179 | |
| 抗PCNA抗体 | Cell Signaling Technology | 13110 | |
| 抗钙网蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 12238 | |
| 抗细胞色素C抗体 | Cell Signaling Technology | 4280 | |
| 抗VDAC1抗体 | Cell Signaling Technology | 4661 | |
| 抗MFN2抗体 | Cell Signaling Technology | 9482 | |
| 抗SRF抗体 | Cell Signaling Technology | 5147 | |
| 抗磷酸化SRF抗体 | Cell Signaling Technology | 4261 | |
| 抗VEGFR1抗体 | Cell Signaling Technology | 2893 | |
| 抗VEGFR2抗体 | Cell Signaling Technology | 2478 | |
| 抗磷酸化VEGFR2抗体 | Cell Signaling Technology | 2479 | |
| 抗VEGFR3抗体 | Cell Signaling Technology | 3408 | |
| 抗IP3R1抗体 | Abcam | ab5804 | |
| 抗IP3R1抗体 | ThermoFisher | PA1-901 | |
| 抗钙联蛋白抗体 | Abcam | ab22595 | |
| 抗FUNDC1抗体 | Aviva Systems Biology | ARP53281 | |
| 抗FUNDC1抗体 | Novus Biologicals | NBP1-81063 | |
| 抗FUNDC1抗体 | EMD Millipore Corporation | ABC506 | |
| 免疫荧光 | MitoTracker® Green FM | ThermoFisher Scientific | 7514 |
| Alexa Fluor 597标记的isolectin GS-IB4 | -- | -- | |
| 管形成实验 | 低生长因子Matrigel | BD Biosciences | 356237 |
| 球体发芽实验 | 甲基纤维素 | Sigma-Aldrich | -- |
| 体内Matrigel plug实验 | Matrigel | BD Biosciences | -- |
| 碱性成纤维细胞生长因子 | -- | -- | |
| 肝素 | -- | -- | |
| Drabkin试剂 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 肿瘤模型 | 抗CD31抗体 | BD Biosciences | 565629 |
| 免疫沉淀 | 抗Flag抗体 | Cell Signaling Technology | 14793 |
| 抗HA抗体 | Cell Signaling Technology | 3724 | |
| RIPA裂解液 | Santa Cruz Biotechnology | sc-24948 | |
| RNA提取 | QIAGEN RNeasy Mini试剂盒 | QIAGEN | 74104 |
| 逆转录 | iScript cDNA合成试剂盒 | Bio-Rad | -- |
| 实时PCR | Brilliant II SYBR Green qPCR预混液 | Stratagene | -- |
| 染色质免疫沉淀 | SimpleChIP®酶法染色质IP试剂盒 | Cell Signaling Technology | -- |
| 荧光素酶实验 | pGL3荧光素酶报告载体 | Promega | -- |
| QuikChange II定点突变试剂盒 | Stratagene | -- | |
| 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | -- | |
| MAM分离 | Percoll | -- | -- |
| 内皮细胞分离 | CD31微珠 | MACS Miltenyi Biotec | 130-097-418 |
| 细胞转染 | Lipofectamine™ RNAiMax转染试剂 | Life Technologies | 13778150 |
| OPTI-MEM减血清培养基 | GIBCO | 31985 | |
| 线粒体自噬检测 | pMT-mKeima-Red质粒 | MBL Medical & Biological Laboratories Co. ltd. | AM-V-251 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| VEGF诱导MAMs形成 | VEGF浓度（30 ng/mL）、处理时间（0、15、60、180 min）、HUVECs来源和代数、n=5独立实验 阅读提示：Fig. 1图注和Methods中“Endoplasmic reticulum and mitochondria contact analysis” |
| FUNDC1敲低效率与MAMs破坏 | FUNDC1 siRNA序列/货号（sc-36563）、转染试剂和条件（RNAiMax，24 h）、敲低效率验证方法 阅读提示：Fig. 2a和图注、Methods中“siRNA transfection” |
| 内皮细胞特异性FUNDC1敲除小鼠 | 小鼠品系背景（C57BL/6J）、Cre品系（Cdh5-Cre）、敲除效率验证、对照组设置（FUNDC1f/YCdh5−） 阅读提示：Methods中“Generation of the endothelial cell-specific FUNDC1 knockout mice”和Supplementary Fig. 3 |
| Matrigel plug实验 | Matrigel体积（0.5 mL/plug）、VEGF（100 ng/mL）、FGF2（250 ng/mL）、heparin（0.0025 Unit/mL）、植入时间（10天）、小鼠周龄（6周） 阅读提示：Methods中“In vivo matrigel plug assay” |
| 抑制肽处理 | 肽序列（peptide-1: YGRKKRRQRRRGVIIDTFADLRS；peptide-2: YGRKKRRQRRRLALILVYLFSI）、体外浓度（20 μM）、体内剂量（10 mg/kg/3天）、给药途径（静脉注射） 阅读提示：Fig. 6图注和Methods中“Peptide synthesis and delivery” |