炎症相关mito-SEPs的蛋白质基因组学筛选
寻找调控炎症的线粒体小开放阅读框编码肽。
对IL-1β处理的HAECs进行配对Ribo-seq与RNA-seq，用RiboTaper鉴定ORF并结合线粒体基序与基因特征预测，筛选出21个候选i-Mito-SEPs，C15ORF48编码的83 aa肽为首选。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
MOCCI（C15ORF48）的编码与非编码功能协同调控宿主炎症与免疫
Coding and non-coding roles of MOCCI (C15ORF48) coordinate to regulate host inflammation and immunity.
实验完整度
高包含HAECs/A549体外模型、AAV9小鼠心脏体内模型、Ribo-seq/RNA-seq组学、蛋白互作与功能验证
主要模型
原代人主动脉内皮细胞（HAECs） A549肺上皮细胞 AAV9介导小鼠心脏过表达模型 HEK293T过表达细胞
重点核对
IL-1β处理剂量1 ng/mL，时间点45 min、12 h、24 h HAECs来源于两名健康男性供者，RNA-seq与Ribo-seq各三次重复 AAV9经胸腔注射6×10^9病毒颗粒至P6 C57BL/6J幼鼠，8–16周后取心脏 DENV/ZIKV感染MOI：HAECs为1.0，A549为0.1，感染后48 h检测病毒基因组 MOCCI-KO使用lentiCRISPRv2 gRNA，1 μg/mL嘌呤霉素筛选
摘要
Mito-SEPs是一类由小开放阅读框编码、定位于线粒体以调控代谢的肽。受mito-SEPs与炎症之间有趣的负相关关系启发，本文筛选可改变炎症结果的mito-SEPs，并报道了一个名为“炎症期间细胞色素C氧化酶调节因子”（MOCCI）的mito-SEP，其在炎症和感染期间上调以促进宿主保护性的炎症消退。MOCCI是细胞色素C氧化酶（复合物IV）NDUFA4亚基的旁系同源物，在炎症期间取代复合物IV中的NDUFA4，以降低线粒体膜电位并减少ROS产生，从而产生细胞保护作用并减弱免疫反应。MOCCI转录本还生成miR-147b，后者靶向NDUFA4 mRNA，具有与MOCCI相似的免疫抑制作用，但同时增强RIG-I/MDA-5介导的抗病毒免疫。本研究揭示了MOCCI（C15ORF48）对宿主炎症和免疫的双组分多效性调控，在感染和炎症期间保护宿主。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- mito-SEPs是否调控炎症，以及C15ORF48编码的MOCCI如何影响宿主炎症与免疫反应。
- 核心机制
- 炎症时C15ORF48上调，MOCCI取代复合物IV中的NDUFA4，降低CIV活性、膜电位和ROS产生；其3′UTR生成的miR-147b靶向NDUFA4 mRNA并经RIG-I/MDA5增强干扰素反应。
- 主要证据
- HAECs与A549中IL-1β诱导NDUFA4-to-MOCCI转换；AAV-MOCCI小鼠心脏线粒体CIV活性降低；MOCCI与NDUFA4不共存于同一CIV复合物；病毒攻击实验显示MOCCI抑制IL-6/MCP-1分泌，miR-147b抑制病毒复制。
- 研究意义
- 作者提出MOCCI-miR-147b轴或调控CIV活性可能成为改善病毒诱导过度炎症的策略，并提示值得研究其在慢性炎症和心血管疾病中的作用。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
MOCCI定位于线粒体内膜并组装入复合物IV
验证MOCCI的亚细胞定位及其与CIV的物理结合。
在MOCCI过表达HEK293T中检测线粒体富集组分，行差异增溶与蛋白酶K保护实验；在AAV-MOCCI小鼠心脏线粒体行BN-PAGE与二维BN-SDS-PAGE，检测MOCCI与MTCO-1共迁移。
炎症诱导NDUFA4-to-MOCCI亚基转换
验证炎症时CIV中NDUFA4被MOCCI取代。
在IL-1β处理的HAECs与A549中检测MOCCI翻译与NDUFA4蛋白变化，并用MOCCI-ORF、WT-mRNA、ATGmut-mRNA过表达及MOCCI-KO区分MOCCI与miR-147b的贡献。
MOCCI对CIV活性、膜电位与ROS的影响
确定MOCCI掺入CIV后的功能后果。
用Seahorse非偶联电子流实验测定AAV-MOCCI小鼠心脏线粒体CIV活性，用透化细胞与RCA法测定CIV活性，用TMRE、JC-1、DCF、Amplex Red和MitoSOX检测膜电位与ROS。
MOCCI与miR-147b对炎症因子分泌的调控
检验MOCCI和miR-147b是否抑制促炎细胞因子产生。
HAECs过表达MOCCI、WT-mRNA、ATGmut-mRNA或转染miR-147b mimic，经DENV/ZIKV或LPS刺激后，用LEGENDplex检测IL-6、MCP-1、IL-8分泌。
miR-147b经RIG-I/MDA5调控干扰素反应与病毒复制
阐明miR-147b增强抗病毒干扰素反应的机制。
在ZIKV感染的HAECs与A549中检测RIG-I、MDA5与磷酸化p65，用qPCR测定病毒基因组拷贝数，用LDH释放测定细胞死亡。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 原代人主动脉内皮细胞 | PromoCell | C12271 |
| 内皮细胞生长培养基MV2 | PromoCell | C22022 | |
| 纤连蛋白 | Promocell | C-43050 | |
| Lipofectamine 2000转染试剂 | Life Technologies | 11668019 | |
| 聚凝胺 | Sigma-Aldrich | 9268 | |
| G418遗传霉素 | Santa Cruz | sc-29065A | |
| 嘌呤霉素 | InvivoGen | ant-pr-1 | |
| 佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯 | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| 脂多糖 | InvivoGen | tlrl-3pelps | |
| 干扰素γ | Miltenyi Biotec | 130-096-481 | |
| 细胞处理 | 白细胞介素-1β | Sigma-Aldrich | SRP3083 |
| 叠氮化钾 | Sigma-Aldrich | 740411 | |
| RNA提取与qPCR | MN Nucleospin RNA提取试剂盒 | Macherey-Nagel | 740955.50 |
| iScript逆转录预混液 | Bio-Rad Laboratories | 1708841 | |
| iTaq通用SYBR Green预混液 | Bio-Rad Laboratories | 1725124 | |
| TaqMan microRNA逆转录试剂盒 | ThermoFisher Scientific | 4366596 | |
| TaqMan通用预混液II（无UNG） | ThermoFisher Scientific | 4440048 | |
| RNA-seq建库 | NEBNext poly(A) mRNA磁珠分离模块 | New England Biolabs | E7490L |
| NEBNext Ultra II定向RNA建库试剂盒 | New England Biolabs | E7765L | |
| Ribo-seq建库 | Truseq核糖体印迹建库试剂盒 | Illumina | RPHMR12126 |
| Ribo-Zero Gold rRNA去除试剂盒 | Illumina | -- | |
| 免疫荧光 | 抗MOCCI抗体 | Sigma-Aldrich | HPA012943 |
| 抗TOMM20抗体 | Abcam | ab56783 | |
| 免疫印迹 | 抗FLAG抗体 | Proteintech | 20543-I-AP |
| 抗MTCO-1抗体 | Abcam | ab14705 | |
| 抗MOCCI抗体 | Novus Biologicals | NBP1-98391 | |
| 抗NDUFA4抗体 | Bioworld Technology | BS3883 | |
| 抗TOMM70抗体 | ABclonal | A4349 | |
| 抗TIM23抗体 | Proteintech | 11123-1-AP | |
| 抗柠檬酸合酶抗体 | Santa Cruz Biotechnology | SC-390693 | |
| 抗COX4抗体 | ABclonal | A10098 | |
| 抗MDA5抗体 | Cell Signaling Technology | 5321 | |
| 抗RIG-I抗体 | Cell Signaling Technology | 4520 | |
| 抗磷酸化p65抗体 | Cell Signaling Technology | 3031 | |
| 免疫共沉淀 | 抗FLAG M2磁珠 | Sigma-Aldrich | A2220 |
| 流式细胞术 | 抗NDUFA4抗体 | Santa Cruz Biotechnology | SC-517091 |
| PE标记抗ICAM-1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-107 PE | |
| PE-Vio770标记抗VCAM-1抗体 | Miltenyi Biotec | 130-104-127 | |
| 细胞活力与ROS检测 | 四甲基罗丹明乙酯 | ThermoFisher Scientific | T669 |
| JC-1荧光探针 | Life Technologies | 65-0851-38 | |
| 2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯 | Sigma-Aldrich | 6883 | |
| 线粒体超氧化物红色荧光探针 | ThermoFisher Scientific | M36008 | |
| 细胞因子检测 | LEGENDplex多因子检测试剂盒 | BioLegend | 740809 |
| LEGENDplex多因子检测试剂盒 | BioLegend | 740503 | |
| 呼吸链酶活性测定 | 细胞色素c | -- | -- |
| Seahorse线粒体压力测试 | XF96细胞培养微孔板 | Agilent Technologies | 101085-004 |
| 寡霉素 | Sigma-Aldrich | G8644 | |
| FCCP解偶联剂 | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| 柠檬酸合酶活性测定 | DTNB | Sigma | D8130 |
| 乙酰辅酶A | Sigma-Aldrich | A2181 | |
| 草酰乙酸 | Sigma | O4126 | |
| AAV生产 | 聚乙烯亚胺PEI MAX 40k | Polysciences | 24765-1 |
| Optiprep密度梯度介质 | Sigma-Aldrich | D1556 | |
| Benzonase核酸酶 | Sigma-Aldrich | E8263 | |
| RNase混合液 | Invitrogen | 10638255 | |
| Amicon Ultra-15离心过滤单元（100 kDa截留） | Millipore | UFC910024 | |
| 质粒转染 | 多聚-L-赖氨酸 | Sigma-Aldrich | P4707 |
| 质粒构建 | lentiCRISPRv2载体 | Addgene | 52961 |
| NF-κB荧光素酶报告载体 | Addgene | 49343 | |
| 蛋白消化与质谱 | 6重串联质量标签 | ThermoFisher Scientific | 90061 |
| Pierce高pH反相肽分级试剂盒 | ThermoFisher Scientific | 84868 | |
| Orbitrap Eclipse三合一质谱仪 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| Ultimate 3000 RSLC纳升液相色谱 | Dionex | Ultimate 3000 | |
| 病毒滴度测定 | BHK-21细胞 | ATCC | CCL-10 |
| 病毒生产 | C6/36蚊源细胞 | ATCC | CRL-1660 |
| 病毒基因组定量 | SsoAdvanced通用探针预混液 | Bio-Rad | 1725281 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| HAECs的IL-1β处理与组学 | IL-1β浓度1 ng/mL；处理时间45 min、12 h、24 h；两名健康男性供者；RNA-seq与Ribo-seq各三次重复 阅读提示：Fig. 1b图注与Methods中Ribo-seq建库部分 |
| MOCCI过表达与敲除 | 慢病毒过表达MOCCI-ORF、WT-mRNA、ATGmut-mRNA；G418 500 μg/mL筛选；MOCCI-KO gRNA序列与1 μg/mL嘌呤霉素筛选 阅读提示：Methods中Generation of MOCCI overexpressing cells与Generation of MOCCI knockout cells |
| AAV9小鼠心脏过表达 | P6 C57BL/6J幼鼠经胸腔注射6×10^9病毒颗粒；8–16周后取心脏；AAV-GFP为阴性对照 阅读提示：Methods中Adeno-associated virus production, purification, and administration |
| CIV活性与线粒体功能检测 | TMPD 100 μM、叠氮化钾15 mM、抗霉素A 1 μM、FCCP 4 μM；TMRE 100 nM、JC-1 1.5 μM、DCF-DA 10 μM、MitoSOX 5 μM；蛋白量归一化方式 阅读提示：Methods中Cellular respirometry and mitochondria flux assays与Mitochondria membrane potential and ROS |
| 病毒与LPS刺激实验 | DENV/ZIKV MOI：HAECs 1.0、A549 0.1；感染后48 h检测病毒基因组；LPS 1 μg/mL；IL-1β 1 ng/mL 阅读提示：Methods中DENV/ZIKV infection assay与Cell culture |
| miR-147b mimic与siNDUFA4转染 | miR-147b mimic浓度5 nM或25 nM；siNDUFA4来源Dharmacon L-019200-01；转染试剂Dharmafect Reagent 1用量2 μL 阅读提示：Methods中Transient overexpression of miR-147b mimic and siRNA |