Rpd3相互作用组分析
鉴定MB神经元中神经活动依赖的Rpd3相互作用蛋白变化
在MB神经元表达Rpd3::FLAG-HA并用dTRPA1热遗传激活，串联亲和纯化后进行shotgun LC-MS/MS分析
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Rpd3/CoRest介导的活动依赖性转录调控果蝇记忆更新的灵活性
Rpd3/CoRest-mediated activity-dependent transcription regulates the flexibility in memory updating in Drosophila.
实验完整度
高结合果蝇蘑菇体神经元蛋白质组学、光遗传/热遗传激活、Western blot、ChIP-seq与RNA-seq及行为学验证
主要模型
果蝇蘑菇体神经元 MBsw/MBsw2驱动转基因果蝇 dTRPA1热遗传激活模型 CsChrimson光遗传激活模型
重点核对
MB神经元中Rpd3::FLAG-HA与CoRest-F/CoRest-C的免疫共沉淀结合变化 CoRest-C K318R敲入对Rpd3/CoRest-F解离的影响 spaced training后kay等IEG mRNA表达时程 CoRest-C/Rpd3/CBP的ChIP-seq共定位 reversal learning后即刻记忆检测
摘要
巩固的记忆可根据环境变化被保留或更新。尽管这种相互冲突的调控可能发生在记忆更新过程中，但记忆更新的灵活性可能在最初的记忆巩固过程中就已经被决定。本文中，我们探索了记忆巩固中活动依赖性转录的门控机制，该机制出人意料地与果蝇后期的记忆更新相关联。通过蛋白质组学分析，我们发现含有组蛋白去乙酰化酶Rpd3和CoRest的转录抑制因子的组成变化，作为打开和关闭活动依赖性转录时间窗口的门控机制发挥作用。通过Rpd3/CoRest的组成变化打开闸门是记忆巩固所必需的，但通过Rpd3/CoRest关闭闸门对于限制未来的记忆更新具有重要意义。我们的数据表明，记忆更新的灵活性由最初的活动依赖性转录决定，提供了一种参与定义记忆状态的机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 记忆巩固中活动依赖性转录的门控机制是什么，以及该机制是否影响后续记忆更新的灵活性。
- 核心机制
- 神经活动经CBP乙酰化CoRest-C，促进其结合Rpd3并解离Rpd3/CoRest-F，打开活动依赖性转录窗口；Rpd3去乙酰化CoRest-C使复合物恢复，关闭转录窗口。
- 主要证据
- 果蝇蘑菇体神经元Rpd3相互作用组分析、光遗传/热遗传激活下的免疫共沉淀与Western blot、kay等基因RT-qPCR、ChIP-seq和RNA-seq，以及CoRest-C敲低和K318R敲入的行为学实验。
- 研究意义
- 提出记忆巩固中活动依赖性转录的开启与关闭分别对记忆巩固和限制行为灵活性重要，为理解记忆状态定义及与自闭症谱系障碍或智力障碍相关的机制提供基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
Rpd3/CoRest复合物组成变化验证
验证神经激活是否引起Rpd3与CoRest-F/CoRest-C结合变化
表达HA标签Rpd3和CsChrimson，光遗传激活后进行免疫共沉淀和Western blot检测CoRest-F与CoRest-C结合
CoRest-C乙酰化及结合位点分析
确定CoRest-C乙酰化及其与Rpd3结合的关键赖氨酸
染色质分级、抗乙酰赖氨酸免疫沉淀、LC-MS/MS鉴定乙酰化位点，并构建K/R突变体检测结合
活动依赖性转录检测
检测Rpd3/CoRest对kay等即早基因转录时程的调控
spaced training后不同时间点取头提取RNA，RT-qPCR检测kay、Myo31DF、sr、h、grh mRNA
全基因组结合与转录分析
确定CoRest-C、Rpd3、CBP共定位基因座及活动依赖性表达谱
收集MB细胞核进行ChIP-seq和核RNA-seq分析
记忆与行为灵活性评估
评估Rpd3/CoRest功能异常对记忆巩固和记忆更新的影响
spaced/massed training后进行1天记忆检测，并在次日进行reversal learning后即刻测试
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 基因表达诱导 | RU486（米非司酮） | Sigma | -- |
| 光遗传激活 | 全反式视黄醛 | Sigma | -- |
| 蛋白纯化 | 抗FLAG M2亲和凝胶 | Sigma | -- |
| 3xFLAG肽 | Sigma | F4799 | |
| 免疫沉淀 | 抗HA抗体偶联磁珠 | Thermo Fisher Scientific | 88837 |
| 抗myc抗体偶联磁珠 | Thermo Fisher Scientific | 88843 | |
| Protein A/G琼脂糖 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Western blot | 鼠单克隆抗myc抗体 | BioLegend | 626802 |
| 兔单克隆抗HA抗体 | Cell Signaling Technology | 3724 | |
| 鼠单克隆抗HA抗体 | BioLegend | 901515 | |
| 兔抗组蛋白H3抗体 | Abcam | ab1791 | |
| 鼠抗α-微管蛋白抗体 | Sigma | T6199 | |
| 免疫沉淀 | 抗乙酰赖氨酸抗体 | Abcam | ab21623 |
| 免疫组织化学 | 兔单克隆抗pERK抗体 | Cell Signaling Technology | 4376 |
| 兔单克隆抗myc抗体 | Cell Signaling Technology | 2278 | |
| 鼠nc82抗体 | Developmental Studies Hybridoma Bank | -- | |
| 兔抗DsRed抗体 | Takara | 632496 | |
| 鸡抗GFP抗体 | Abcam | ab13970 | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| cDNA合成 | ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover | TOYOBO | -- |
| ChIP-seq建库 | NEBNext Ultra II DNA文库构建试剂盒（Illumina） | New England Biolabs Inc. | -- |
| RNA-seq建库 | NEBNext Ultra II RNA文库构建试剂盒（Illumina） | New England Biolabs Inc. | -- |
| mRNA富集 | Oligo d(T)25磁珠 | New England Biolabs Inc. | -- |
| 蛋白消化 | 改良胰蛋白酶 | Promega | -- |
| Glu-C蛋白酶 | Thermo Scientific | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| Rpd3相互作用组分析 | 果蝇数量约2000只；35 °C热激1 h；MBsw驱动Rpd3::FLAG-HA表达；阴性对照为无dTRPA1果蝇 阅读提示：Methods中Shotgun LC-MS/MS分析与Fig. 1b图注 |
| 光遗传激活 | 0.4 mM all-trans-retinal喂食3天；617 nm红光40 Hz、脉宽12.5 ms；CsChrimson表达 阅读提示：Methods中Thermogenetic and optogenetic manipulation |
| CoRest-C乙酰化与结合 | K318为主要乙酰化位点；NaBu浓度文中未明确说明；Rpd3-H137A突变 阅读提示：Fig. 4c、Fig. 5c–e图注及Methods中Pull-down assay |
| ChIP-seq与RNA-seq | MB核收集约500只果蝇；抗myc、抗CBP、抗Rpd3抗体用量；n=3生物学重复；光激活5 min后休息10 min 阅读提示：Methods中Purification of MB nuclei、ChIP-seq analysis与RNA-seq analysis |
| 行为学训练 | 约70只果蝇；OCT与MCH气味；60 V电击1.5 s每5 s；spaced training五轮间隔15 min；训练后17 °C保存 阅读提示：Methods中Behavioral assay |