端粒重复序列的大规模纯化
建立从哺乳动物细胞中高效富集端粒重复序列的方法，以便进行结构分析
约2.5 mg小鼠基因组DNA用HinfI和MspI消化，蔗糖梯度离心收集高分子量组分，再用RsaI、AluI、MboI、HinfI、MspI、HphI、MnlI消化，经制备型琼脂糖凝胶回收大于5 kb的DNA片段。
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端粒损伤诱导内部环结构进而产生端粒环
Telomere damage induces internal loops that generate telomeric circles.
实验完整度
高体外DNA模型、细胞系、电镜结构分析、2D凝胶、C-circle assay等多层证据，且有功能与机制验证
主要模型
SV40LT永生化MEFs U2OS细胞 HeLa 1.3细胞 HeLa 204和HTC75细胞
重点核对
端粒富集：约2.5 mg基因组DNA，HinfI/MspI消化，蔗糖梯度离心，再次消化后琼脂糖凝胶分离 DNase I处理分离的细胞核：在0、1、2.5或5 µg/ml DNase I室温处理8分钟 DNase I处理分离的DNA：在0、0.1、0.2或0.4 µg/ml DNase I室温处理8分钟 补骨脂素交联：30 µg/ml 4,5′,8-三甲基补骨脂素，365 nm UV照射8分钟，共4个循环 HeLa核提取物孵育：1 µg DNA与60 µg HeLa核提取物在含5 mM MgCl2和2 mM ATP的缓冲液中37°C孵育35分钟
摘要
染色体外端粒环通常被认为在端粒维持中起重要作用，但其来源仍不清楚。通过对纯化端粒的电子显微镜分析，我们发现除了已知结构外，端粒重复序列会积累内部环（i-loops），这些结构出现在切口和单链DNA缺口附近。i-loops可由正常端粒上的单链损伤诱导产生，并且是ALT（端粒替代延长）肿瘤细胞中检测到的主要端粒结构。我们的数据表明，i-loops的形成是端粒重复序列处单链DNA暴露的结果。最后，我们证明这些损伤诱导的i-loops可被切除从而生成染色体外端粒环，导致端粒重复序列丢失。我们的结果将损伤诱导的i-loops鉴定为端粒代谢中的新中间体，并揭示了一种将端粒损伤与染色体外端粒环积累及端粒侵蚀联系起来的简单机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 端粒环（t-circles）是如何产生的，以及端粒损伤是否参与其形成？
- 核心机制
- 端粒重复序列处的单链损伤（切口和缺口）通过退火和分支迁移形成内部环（i-loops）；i-loops可作为Holliday连接解离酶的底物被切除，生成染色体外端粒环并导致端粒重复序列丢失。
- 主要证据
- 电镜显示端粒富集样本中i-loops出现频率约14%（对照约3%）；DNase I处理诱导t-circle弧和i-loops增加；HeLa核提取物与DNase I处理联合使端粒环增加5倍，且依赖Mg++和ATP。
- 研究意义
- 鉴定损伤诱导的i-loops为端粒环形成的关键中间体，提供了一种将端粒损伤与染色体外端粒环积累及端粒侵蚀联系起来的机制，并可能解释ALT细胞中端粒环的持续产生。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
端粒富集样本的电镜结构分析
观察端粒富集样本中是否存在除t-loops外的其他结构，并量化i-loops的频率
端粒富集DNA经补骨脂素交联后，用BAC法铺展并进行铂旋转投影，透射电镜观察i-loops、t-loops等结构；对照为限制性内切酶消化的基因组DNA。
ALT细胞中端粒结构的二维凝胶分离与电镜鉴定
确定ALT细胞中二维凝胶t-circle弧内的端粒结构类型
U2OS细胞基因组DNA经端粒富集后，在第二轮富集中用二维凝胶分离，分别切取t-circle弧和线性端粒区域，回收DNA进行电镜分析。
DNase I诱导端粒单链损伤并检测t-circle弧和i-loops
验证端粒单链损伤是否足以诱导i-loops形成和t-circle弧出现
分离的MEF细胞核或纯化的基因组DNA用不同浓度DNase I处理，经二维凝胶和端粒探针杂交检测t-circle弧；大规模处理后再经端粒富集和电镜分析i-loops频率。
补骨脂素交联对i-loop形成的影响
检验i-loop形成是否需要DNA分支迁移
在DNase I处理前对细胞核进行补骨脂素交联，然后进行二维凝胶分析；另外对U2OS细胞进行补骨脂素交联后直接分析t-circle弧。
体外检测i-loops作为端粒环生成底物
验证i-loops能否在核提取物作用下被切除生成端粒环
小鼠基因组DNA经低浓度DNase I处理诱导i-loops，然后与HeLa核提取物孵育，最后用C-circle assay检测端粒环。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证分子表达变化
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | D-MEM培养基 | Lonza | BE12-614F |
| 胎牛血清 | EuroClone | ECS0180L | |
| L-谷氨酰胺 | EuroClone | LOBE17605F | |
| 青霉素-链霉素 | EuroClone | ECB3001L | |
| 非必需氨基酸 | Microtech | X-0557 | |
| Mc Coy’s 5 A培养基（含Glutamax） | Life Technologies | 36600-088 | |
| GenePrint® 10系统 | Promega | B9510 | |
| 支原体检测 | MycoAlert检测试剂盒 | Lonza | LT07-418 |
| 补骨脂素交联 | 4,5′,8-三甲基补骨脂素 | Sigma | T6137 |
| UV Stratalinker 1800交联仪 | Stratagene | -- | |
| DNA提取 | RNase A | Sigma | R500 |
| 蛋白酶K | Roche | 3115887001 | |
| 氯仿 | VWR | 22711 | |
| 端粒富集 | HinfI限制性内切酶 | NEB | -- |
| MspI限制性内切酶 | NEB | -- | |
| RsaI限制性内切酶 | NEB | -- | |
| AluI限制性内切酶 | NEB | -- | |
| MboI限制性内切酶 | NEB | -- | |
| HphI限制性内切酶 | NEB | -- | |
| MnlI限制性内切酶 | NEB | -- | |
| Amicon Ultra-15超滤离心管（30 kDa截留） | Millipore/MERCK | UFC903024 | |
| SeaPlaque低熔点琼脂糖 | Lonza | 50100 | |
| 硅胶珠DNA凝胶回收试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | K0513 | |
| Qubit dsDNA HS检测试剂盒 | Invitrogen | Q32854 | |
| 单分子分析 | 硅烷化盖玻片 | Genomic Vision | COV-002 |
| DNA纤维梳装置 | Genomic Vision | MSC-001 | |
| 抗单链DNA抗体 | Sigma | MAB3034 | |
| Alexa488标记抗小鼠二抗 | Invitrogen | A1101 | |
| Cy3标记TTAGGG3 PNA探针 | PNA Bio | F1006 | |
| 甲酰胺 | Thermo Scientific | 17899 | |
| 封闭试剂 | Roche | 11096176001 | |
| ProLong Gold抗淬灭封片剂 | Invitrogen | P36930 | |
| DV Elite成像系统 | GE Healthcare | -- | |
| IX71显微镜 | Olympus | -- | |
| CSU转盘共聚焦显微镜 | Olympus | -- | |
| Ixon Ultra 897相机 | Andor | -- | |
| 电镜分析 | 苯扎氯铵 | Sigma | B6285 |
| 云母片 | Ted pella inc | 52-6 | |
| 电镜载网 | Nanovision | PEG400 | |
| MED020电子束蒸发仪 | Leica | -- | |
| 低角度载网投影试剂盒 | Leica | 16770525 | |
| 醋酸铀 | -- | -- | |
| 细胞色素C | Sigma | -- | |
| FEI Tecnai12 Bio twin透射电镜 | FEI | -- | |
| GATAN Orius SC-1000相机 | GATAN | -- | |
| DNase I处理 | 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | 11836170001 |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| 二维凝胶电泳 | 琼脂糖 | US-biological | A1015 |
| Amersham Hybond-X膜 | GE healthcare | RPN203 | |
| FUJIFILM存储磷屏 | FUJIFILM | MS3543 E | |
| Typhon Trio激光扫描仪 | GE | -- | |
| 核提取物孵育 | HeLa核提取物 | IPRACELL | CC012010 |
| C-circle assay | Phi29聚合酶 | NEB | M0269 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 端粒富集 | 起始DNA量（约2.5 mg）、限制性内切酶种类与用量（HinfI/MspI 750单位；RsaI等50单位）、蔗糖梯度离心参数（SW32-Ti转子，30100 rpm，16小时） 阅读提示：Methods中“Enrichment of telomeric repeats”小节及Fig. 1图注 |
| 电镜分析 | DNA用量（5-20 ng）、铺展方法（BAC法）、交联条件（30 µg/ml补骨脂素，365 nm UV，4个循环）、统计分子数 阅读提示：Methods中“Electron microscopy analysis”小节及Fig. 2、Fig. 4图注 |
| DNase I处理 | DNase I浓度（细胞核：0、1、2.5、5 µg/ml；DNA：0、0.1、0.2、0.4 µg/ml）、处理时间（8分钟）、温度（室温）、终止缓冲液 阅读提示：Methods中“DNase I treatment on isolated nuclei”和“DNase I treatment on isolated DNA”小节及Fig. 5图注 |
| 二维凝胶电泳 | DNA上样量（10 µg）、消化酶（AluI和MboI各20单位）、第一维和第二维琼脂糖浓度与电泳条件、切胶区域（>5 kb或>2 kb） 阅读提示：Methods中“Two-dimensional agarose gel electrophoresis”小节及Fig. 4、Fig. 5图注 |
| HeLa核提取物孵育与C-circle assay | 核提取物用量（60 µg）、孵育时间（35分钟）、温度（37°C）、缓冲液组分（MgCl2、ATP）、C-circle assay中Phi29聚合酶用量（7.5单位）和孵育时间（12小时，30°C） 阅读提示：Methods中“Incubation with HeLa extracts”和“C-circle assay”小节及Fig. 7图注 |