Tres模型构建与验证
识别对免疫抑制信号具有韧性的T细胞基因特征
利用单细胞转录组数据，通过CytoSig预测TGF-β1、TRAIL和PGE2信号活性，并通过交互检验计算Tres评分。在36个数据集、168个肿瘤中验证。
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一种与多种肿瘤类型免疫治疗反应相关的T细胞韧性模型
A T cell resilience model associated with response to immunotherapy in multiple tumor types
实验完整度
高包含计算模型构建与验证、功能验证（CRISPR敲除）、体外共培养杀伤、体内过继转移模型及机制研究（RNA-seq、Western blot、流式）等多层级实验。
主要模型
Pmel-1 TCR转基因小鼠CD8+ T细胞 NY-ESO-1 TCR转导的人供体CD8+ T细胞 B16-mhgp100黑色素瘤小鼠模型 A375和Mel624黑色素瘤细胞系
重点核对
Tres模型的训练数据为36个单细胞RNA-seq数据集、168个肿瘤、19种癌症类型 预测免疫治疗反应时使用ICI治疗前肿瘤样本（n=38）、CAR-T输注产品（n=34）和制造前样本（n=84） CRISPR敲除使用Cas9-RNP核转染，每基因使用三个独立gRNA 体外共培养杀伤实验使用效应细胞与靶细胞比例（E:T）为2:1或4:1 体内过继转移实验使用C57BL/6小鼠，每组15只，B16-mhgp100细胞皮下注射，600 cGy照射，输注1×10^6个T细胞
摘要
尽管癌症免疫治疗取得了突破性进展，但大多数肿瘤反应性T细胞由于免疫抑制微环境而无法在实体瘤中持续存在。我们开发了Tres（肿瘤韧性T细胞，https://resilience.ccr.cancer.gov/），一种利用单细胞转录组数据识别对免疫抑制信号（如转化生长因子-β1、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体和前列腺素E2）具有韧性的T细胞特征的计算模型。Tres利用来自接受免疫检查点抑制剂治疗的患者治疗前肿瘤的批量T细胞转录组数据（n=38）、嵌合抗原受体T细胞疗法的输注产品（n=34）以及嵌合抗原受体T细胞或肿瘤浸润淋巴细胞疗法的制造前样本（n=84），可靠预测黑色素瘤、肺癌、三阴性乳腺癌和B细胞恶性肿瘤对免疫治疗的临床反应。此外，Tres确定了FIBP（其功能在很大程度上未知）作为多种实体瘤类型中肿瘤韧性T细胞的最高阴性标志物。小鼠和人类供体CD8+ T细胞中的FIBP敲除显著增强了体外共培养中T细胞介导的癌症杀伤。此外，小鼠T细胞中的Fibp敲除增强了B16肿瘤模型中过继细胞转移的体内疗效。Fibp敲除T细胞表现出胆固醇代谢降低，这抑制了效应T细胞功能。这些结果证明了Tres在识别T细胞有效性生物标志物和实体瘤免疫治疗潜在治疗靶点方面的实用性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何识别对免疫抑制信号具有韧性的肿瘤反应性T细胞，并预测免疫治疗反应？
- 核心机制
- FIBP通过促进胆固醇代谢抑制T细胞抗肿瘤功能；FIBP敲除降低胆固醇代谢，增强T细胞杀伤能力。
- 主要证据
- Tres模型预测免疫治疗反应；FIBP敲除增强人和小鼠T细胞体外杀伤及体内抗肿瘤效果；RNA-seq显示胆固醇代谢通路下调。
- 研究意义
- Tres可作为发现T细胞有效性生物标志物和免疫治疗靶点的工具，FIBP可能是增强过继T细胞疗法的潜在治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
预测免疫治疗反应
评估Tres签名预测免疫治疗临床反应的能力
使用预处理的T细胞转录组数据，计算与Tres签名的相关性，预测ICI和ACT反应。
功能验证：CRISPR敲除
验证Tres识别的候选基因是否影响T细胞杀伤能力
通过Cas9-RNP核转染敲除小鼠Pmel-1或人CD8+ T细胞中的候选基因，包括FIBP，并进行体外共培养杀伤实验。
体内疗效评估
评估Fibp敲除T细胞在体内的抗肿瘤效果
在B16-mhgp100小鼠模型中，过继转移Fibp敲除的Pmel-1 T细胞，测量肿瘤生长和生存。
机制研究：胆固醇代谢
探究FIBP影响T细胞功能的分子机制
对Fibp敲除和对照T细胞进行RNA-seq和通路分析，验证胆固醇代谢相关基因表达，并用Western blot和流式检测胆固醇水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
验证机制链路
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco BRL | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | -- | |
| DMEM培养基 | Gibco | -- | |
| T细胞培养 | X-Vivo 15无血清造血细胞培养基 | Lonza | -- |
| N-乙酰L-半胱氨酸 | Sigma | -- | |
| EasySep小鼠CD8+ T细胞分选试剂盒 | STEMCELL | 19853 | |
| 抗小鼠CD3抗体 | TONBO | 40-0032-U100 | |
| 抗小鼠CD28抗体 | TONBO | 40-0281-U100 | |
| 重组小鼠IL-2 | BioLegend | 575406 | |
| HEPES | Gibco | -- | |
| L-谷氨酰胺 | Gibco | -- | |
| 细胞培养 | tdTomato标记 | Addgene | 106173 |
| 慢病毒包装 | psPAX2包装质粒 | Addgene | 12260 |
| pMD2.G包膜质粒 | Addgene | 12259 | |
| 细胞系构建 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | 11668030 |
| 聚凝胺 | Sigma | TR-1003 | |
| 杀稻瘟菌素 | Gibco | A1113903 | |
| CRISPR敲除 | Cas9蛋白 | Berkeley MacroLab | -- |
| tracrRNA | IDT | 1072533 | |
| crRNA | IDT | -- | |
| P3缓冲液 | Lonza | -- | |
| 核转染比色杯 | Lonza | V4XP-3024 | |
| 基因过表达 | pCDH-EF1-MCS-IRES-puro载体 | -- | -- |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Thermo Fisher | 15596026 |
| PrimeScript RT试剂盒（含gDNA去除剂） | Takara | RR047A | |
| TB绿色Premix Ex Taq试剂盒 | Takara | RR420A | |
| Western blot | RIPA裂解缓冲液 | Thermo Fisher | 89900 |
| 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物 | Thermo Fisher | 78441 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris凝胶 | Invitrogen | -- | |
| 硝酸纤维素膜 | Life Technologies | -- | |
| ECL Western印迹检测试剂 | GE healthcare | -- | |
| 流式细胞术 | BD LSR Fortessa SORP I流式细胞仪 | BD | -- |
| FACS CantoII分析仪 | BD | -- | |
| BD FACSymphony流式细胞仪 | BD | -- | |
| ACEA Novocyte Quanteon流式细胞仪 | ACEA | -- | |
| FlowJo软件 | -- | -- | |
| DAPI染料 | -- | -- | |
| Zombie NIR固定化活力试剂盒 | BioLegend | 423105 | |
| 细胞增殖 | CFSE染料 | BioLegend | 423801 |
| 共培养杀伤 | Incucyte实时细胞成像系统 | Essen BioScience | -- |
| ELISA | TNF-α DuoSet ELISA试剂盒 | R&D | DY410 |
| IFN-γ DuoSet ELISA试剂盒 | R&D | DY485 | |
| 动物模型 | C57BL/6小鼠 | Charles River Laboratories | -- |
| 细胞培养 | A375细胞系 | ATCC | CRL-1619 |
| RNA-seq | PureLink RNA小提试剂盒 | Thermo Fisher | 12183020 |
| DNase I | Thermo Fisher | 89836 | |
| 胆固醇检测 | 细胞胆固醇检测试剂盒 | Cayman | 10009779 |
| 胆固醇提取试剂盒 | Sigma | MAK175 | |
| Amplex Red胆固醇检测试剂盒 | Invitrogen | A12216 | |
| LDL摄取 | LDL-Dylight 488 | Cayman | 601470 |
| 药物处理 | 辛伐他汀 | Sigma | PHR1438 |
| RIPA裂解 | 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物 | Thermo Fisher | 78441 |
| 组织消化 | DNase I | Sigma | DN-25 |
| Liberase | Sigma | 5401020001 | |
| 细胞分离 | CD8+ TIL磁珠 | Miltenyi | 130-116-478 |
| 细胞因子检测 | TNF-α DuoSet ELISA试剂盒 | R&D | DY410 |
| IFN-γ DuoSet ELISA试剂盒 | R&D | DY485 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| Tres模型训练 | 训练数据：36个单细胞RNA-seq数据集、168个肿瘤、19种癌症类型；标准化方法：log2(TPM/10+1)；基因标准化：零均值；应激基因移除 阅读提示：Methods: Processing of single-cell RNA-seq data |
| 免疫治疗反应预测 | 验证数据集：ICI治疗前肿瘤样本（n=38）、CAR-T输注产品（n=34）、制造前样本（n=84）；相关性计算方法 阅读提示：Results: Tres signature correlations predict immunotherapy outcomes; Methods |
| CRISPR敲除 | Cas9-RNP核转染条件：脉冲程序CM137（小鼠）和EH100（人）；细胞密度；gRNA设计 阅读提示：Methods: Cas9 ribonucleotide protein nucleofection |
| 体外共培养杀伤 | 效应细胞与靶细胞比例：2:1或4:1；肿瘤细胞密度：A375/Mel624为5000细胞/孔，B16-mhgp100为2500细胞/孔；检测时间点 阅读提示：Methods: Cancer cell and T cell in vitro co-culture assay |
| 体内过继转移 | 小鼠品系：C57BL/6；每组15只；B16-mhgp100接种：5×10^5细胞；照射剂量：600 cGy；T细胞输注：1×10^6；IL-2给药：1×10^5 IU，每日两次，连续3天 阅读提示：Methods: Adoptive T cell transfer |