UPR诱导与时间进程验证
确认UPR在LN-308细胞中被激活并确定采样时间点。
用TM或TH处理LN-308细胞，通过RT-PCR检测XBP1剪接，Western blot检测PERK、EIF2S1磷酸化、ATF4和HSPA5。
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多组学分析揭示未折叠蛋白反应调节子及应激诱导的叶酸类抗代谢药物耐药性
A multi-omics analysis reveals the unfolded protein response regulon and stress-induced resistance to folate-based antimetabolites.
实验完整度
高多组学（转录组、蛋白质组、翻译组）与细胞功能验证（药物敏感性、代谢流）及机制验证（通路抑制、突变体）
主要模型
LN-308人星形细胞瘤细胞系 A549人腺癌细胞系 Flp-In T-REx HEK293细胞系
重点核对
UPR诱导浓度：200 nM Thapsigargin或2.5 µg/ml Tunicamycin UPR分支抑制：50 µM STF-083010（IRE1）、1 µM GSK2606414（PERK）、1 µM CeapinA7（ATF6） EIF2S1突变体：S51D（磷酸化模拟）和S51A（不可磷酸化），四环素1 µg/ml诱导24 h 代谢标记：400 µM 稳定同位素标记丝氨酸示踪24 h 细胞活力检测：24 h处理，CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay
摘要
应激反应通路对细胞稳态至关重要，通过基因表达和代谢的适应性变化促进生存。它们在许多疾病中发挥关键作用，并与癌症进展和化疗耐药相关。然而，其潜在机制仍知之甚少。我们采用多组学方法监测应激反应通路——未折叠蛋白反应（UPR）诱导后基因表达的变化，并行探测转录组、蛋白质组和翻译变化。严格过滤揭示267个基因的诱导，其中许多此前未涉及应激反应通路。我们通过实验证明，UPR介导的翻译控制诱导参与将糖酵解中间代谢物分流以驱动线粒体一碳代谢的酶的表达。同时，细胞对叶酸类抗代谢药物甲氨蝶呤和培美曲塞产生耐药性，从而建立UPR驱动的基因表达变化与药理治疗耐药性之间的直接联系。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- UPR如何通过转录和翻译重编程导致对叶酸类抗代谢药物的耐药性？
- 核心机制
- UPR通过PERK–EIF2S1–ATF4通路诱导SLFN5及丝氨酸生物合成和一碳代谢酶（PHGDH、PSAT1、PSPH、SHMT2、MTHFD2、ALDH1L2）表达，增强线粒体一碳代谢，从而抵抗叶酸类抗代谢药物。
- 主要证据
- 多组学（RNA-seq、核糖体 profiling、蛋白质组）鉴定UPR调节子；药理学抑制和EIF2S1突变体证实PERK–EIF2S1–ATF4依赖性；代谢示踪显示线粒体一碳代谢流增加；细胞活力实验显示甲氨蝶呤和培美曲塞IC50升高约10,000倍。
- 研究意义
- 建立UPR驱动的基因表达变化与叶酸类抗代谢药物耐药性的直接联系，提示应激介导的EIF2S1磷酸化是多种细胞类型中可广泛激活的耐药机制。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
多组学数据采集与整合
全面监测UPR诱导后的转录组、翻译组和蛋白质组变化。
对TM或TH处理的LN-308细胞进行RNA-seq、核糖体 profiling和shotgun/靶向蛋白质组分析，并整合数据。
UPR调节子定义与SLFN5验证
鉴定UPR诱导基因并验证SLFN5的UPR依赖性。
通过严格过滤定义267个基因的UPR调节子；用PERK、IRE1、ATF6抑制剂及EIF2S1突变体、ATF4过表达验证SLFN5、SHMT2、MTHFD2的诱导。
代谢重编程与耐药性评估
验证UPR诱导的一碳代谢变化及其对叶酸类抗代谢药物敏感性的影响。
检测NADP/NADPH比值、氨基酸水平、稳定同位素丝氨酸示踪代谢流；用细胞活力实验测定多种化疗药物的IC50。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 毒胡萝卜素 | -- | -- |
| 衣霉素 | -- | -- | |
| UPR分支抑制 | STF-083010 | -- | -- |
| GSK2606414 | -- | -- | |
| CeapinA7 | -- | -- | |
| HRI激活 | BTdCPU | -- | -- |
| NCPdCPU | -- | -- | |
| EIF2S1去磷酸化抑制 | Salubrinal | -- | -- |
| Western blot | 抗BIP抗体 | Cell Signaling Technology | 3177 |
| 抗IRE1抗体 | Abcam | ab96481 | |
| 抗XBP1抗体 | Biolegend | 619501 | |
| 抗ATF4抗体 | Cell Signaling Technology | 11815 | |
| 抗eIF2α抗体 | Cell Signaling Technology | 5324 | |
| 抗磷酸化eIF2α (Ser51)抗体 | Abcam | ab32157 | |
| 抗α-微管蛋白抗体 | Sigma | DM1A | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Sigma | A2066 | |
| 抗PERK抗体 | Cell Signaling Technology | 3192 | |
| 抗SLFN5抗体 | Sigma | HPA017760 | |
| 抗HA标签抗体 | Sigma | HA-7 | |
| 细胞活力检测 | CellTiter 96® AQueous One Solution细胞增殖检测 | Promega | -- |
| 代谢分析 | NADP/NADPH-Glo检测 | Promega | -- |
| 代谢标记 | 稳定同位素标记丝氨酸 | Cambridge Isotope Laboratories | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| UPR诱导 | TM和TH的浓度（2.5 µg/ml和200 nM）及处理时间（2、6、16、24 h） 阅读提示：Methods中Cell culture小节及Results中'Induction of the UPR in LN-308 cells' |
| UPR分支抑制 | 抑制剂浓度：STF-083010 50 µM、GSK2606414 1 µM、CeapinA7 1 µM；TM共处理6 h 阅读提示：Methods中Cell culture小节及Fig. 4a图注 |
| EIF2S1突变体表达 | 四环素诱导浓度1 µg/ml，诱导时间24 h；细胞系为Flp-In T-REx HEK293 阅读提示：Methods中Cell culture小节及Fig. 4b图注 |
| 代谢标记与代谢物分析 | 标记丝氨酸浓度400 µM，标记时间24 h；内标混合物组成 阅读提示：Methods中'Labeling with serine and metabolite analyses'小节 |
| 细胞活力检测 | 化疗药物浓度梯度、处理时间24 h、TM共处理浓度2.5 µg/ml 阅读提示：Methods中Viability assays小节及Fig. 6图注 |