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        基因毒性应激触发IRE1α依赖性RNA降解的激活以调节DNA损伤反应

        Genotoxic stress triggers the activation of IRE1α-dependent RNA decay to modulate the DNA damage response.

        作者信息Estefanie Dufey, José Manuel Bravo-San Pedro, Cristian Eggers, Matías González-Quiroz, Hery Urra, Alfredo I Sagredo, Denisse Sepulveda, Philippe Pihán, Amado Carreras-Sureda, Younis Hazari, Eduardo A Sagredo, Daniela Gutierrez, Cristian Valls, Alexandra Papaioannou, Diego Acosta-Alvear, Gisela Campos, Pedro M Domingos, Rémy Pedeux, Eric Chevet, Alejandra Alvarez, Patricio Godoy, Peter Walter, Alvaro Glavic, Guido Kroemer, Claudio Hetz
        PMID32409639
        期刊Nat Commun
        发布时间2020-05-14
        DOI10.1038/s41467-020-15694-y
        来源查看原文

        实验完整度

        高

        包含MEF/HEK细胞体外模型、果蝇和小鼠体内模型，并有RNA切割、寡聚化、PLA等机制验证和功能验证

        主要模型

        小鼠胚胎成纤维细胞（MEF） HEK-293T细胞 果蝇（D. melanogaster）幼虫及成虫 IRE1α条件性敲除小鼠（肝和骨髓）

        重点核对

        MEF细胞中IRE1α敲除与IRE1α-HA回补的对比 依托泊苷处理浓度与时间（如10 μM，8-16 h） Xbp1 mRNA剪接检测（RT-PCR和实时PCR） RIDD底物（Bloc1s1、Sparc、Ppp2r1a、Ruvbl1）mRNA降解检测 体内小鼠依托泊苷剂量（50 mg/Kg，腹腔注射）

        摘要

        维持基因组完整性和蛋白质稳态的内稳态系统之间的分子联系尚不清楚。在此，我们发现在基因毒性应激下，未折叠蛋白反应传感器IRE1α被选择性激活，以调节修复程序并维持细胞存活。DNA损伤在没有内质网（ER）应激特征的情况下激活IRE1α信号，导致选择性激活受调控的IRE1α依赖性降解（RIDD），而不激活由转录因子XBP1介导的经典输出。IRE1α内切核糖核酸酶活性控制参与DNA损伤反应的mRNA的稳定性，影响DNA修复、细胞周期阻滞和凋亡。DNA损伤激活c-Abl激酶，触发IRE1α寡聚化以催化RIDD。IRE1α在基因毒性应激下的保护作用在果蝇和小鼠中是保守的。总之，我们的结果揭示了维持基因组稳定性和蛋白质稳态的分子途径之间的重要交叉点。

        实验结论

        提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。

        研究问题
        基因毒性应激下，IRE1α是否以及如何参与DNA损伤反应（DDR）的调控？
        核心机制
        DNA损伤激活c-Abl激酶，促进IRE1α寡聚化并选择性激活其内切核糖核酸酶活性（RIDD），降解Ppp2r1a和Ruvbl1等DDR相关mRNA，从而调控γ-H2AX磷酸化及CHK1/CHK2激活，影响DNA修复、细胞周期阻滞和存活。
        主要证据
        在MEF和HEK细胞中，DNA损伤诱导IRE1α磷酸化和聚集但不引发Xbp1剪接；IRE1α缺失导致Ppp2r1a/Ruvbl1 mRNA稳定性增加、γ-H2AX衰减加快、CHK1/2磷酸化减弱、DNA损伤增加和细胞死亡敏感性升高；c-Abl缺失或抑制阻断RIDD；果蝇和小鼠IRE1α缺失加剧基因毒性应激敏感性。
        研究意义
        揭示了IRE1α作为DDR信号模块的非经典功能，建立了基因组稳定性维持与蛋白质稳态网络之间的直接分子联系，提示IRE1α功能缺失可能促进基因组不稳定性。

        研究路径

        按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

        1

        DNA损伤诱导IRE1α选择性激活RIDD

        验证基因毒性应激是否激活IRE1α及其下游输出

        用依托泊苷或γ射线处理MEF细胞，检测IRE1α磷酸化、聚集、Xbp1 mRNA剪接及RIDD底物mRNA降解

        2

        IRE1α对基因毒性应激下细胞存活和DDR信号的影响

        评估IRE1α缺失对DNA损伤后细胞存活、DNA修复和细胞周期的影响

        比较WT和IRE1α KO细胞在依托泊苷、5-FU、HU或γ射线处理后的存活率、caspase-3激活、γ-H2AX动力学、 comet assay、微核试验、细胞周期及CHK1/CHK2磷酸化

        3

        鉴定RIDD靶mRNA及其功能贡献

        确定IRE1α通过RIDD调控的DDR相关mRNA并验证其功能

        通过实时PCR检测Ppp2r1a和Ruvbl1 mRNA降解，体外RNA切割实验验证IRE1α直接切割，shRNA敲低Ppp2r1a或Ruvbl1以挽救IRE1α KO表型

        4

        c-Abl在DNA损伤下激活IRE1α的作用

        探究DNA损伤如何激活IRE1α的RIDD活性

        使用c-Abl抑制剂伊马替尼、shRNA敲低c-Abl或CRISPR/Cas9敲除c-Abl，检测RIDD活性、IRE1α聚集及c-Abl与IRE1α相互作用（共免疫沉淀、PLA、体外寡聚化实验）

        5

        果蝇模型验证IRE1α的体内保护作用

        在体内验证IRE1α对基因毒性应激的保护作用

        使用dIre1 RNAi或突变体果蝇，喂食依托泊苷或多柔比星，检测RIDD、生存率、SMART试验、caspase-3激活及MARCM克隆分析

        6

        小鼠模型验证IRE1α在肝脏DDR中的作用

        在哺乳动物体内验证IRE1α对DNA损伤反应的调控

        使用Mx-Cre系统在肝脏和骨髓条件性敲除IRE1α，注射依托泊苷或衣霉素，检测Xbp1剪接、RIDD、CHK1磷酸化、caspase-3激活及基因表达谱

        研究方法

        按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。

        验证样本或模型特征
        蛋白质印迹法逆转录PCR实时PCRPhostag磷酸化检测共聚焦显微镜
        验证细胞功能变化
        碘化丙啶染色和流式细胞术彗星试验胞质分裂阻滞微核细胞组试验细胞周期分析Caspase-3激活检测
        验证分子表达变化
        免疫荧光免疫组织化学微阵列分析
        验证机制链路
        共免疫沉淀邻位连接试验体外RNA切割试验体外寡聚化试验shRNA敲低CRISPR/Cas9敲除
        评估体内效果
        体细胞突变和重组试验可抑制细胞标记物的嵌合分析生存分析
        数据分析与统计
        单因素方差分析双因素方差分析Student t检验

        产品清单

        实验环节名称品牌货号
        药物处理依托泊苷Sigma Aldrich--
        多柔比星Sigma Aldrich--
        5-氟尿嘧啶Sigma Aldrich--
        羟基脲Sigma Aldrich--
        伊马替尼Sigma Aldrich--
        4μ8CSigma Aldrich--
        衣霉素Calbiochem EMB Bioscience Inc.--
        MKC-8866Fosun Orinove--
        细胞培养杜尔贝科改良伊格尔培养基Life Technologies--
        胎牛血清Life Technologies--
        Western blot抗BiP抗体Abcamab21685
        抗磷酸化S139-H2AX抗体Millipore05-636
        抗DDIT3（CHOP）抗体Santa Cruzsc-575
        抗XBP1s抗体Santa Cruz7160
        抗ATF4抗体Santa Cruzsc-200
        抗Hsp90抗体Santa Cruzsc-13119
        抗IRE1α（14C10）抗体Santa Cruz3294
        抗Chk1抗体Santa Cruzsc-8408
        抗Chk2抗体Santa Cruzsc-17747
        抗磷酸化Chk2（Thr68）抗体Santa Cruzsc-16297-R
        抗ATM抗体Santa Cruzsc-7129
        抗HA抗体Roche11666606001
        抗PP2A A抗体Cell Signaling technology2041S
        抗RuvbL1抗体Cell Signaling technology12300
        抗eIF2α抗体Cell Signaling technology9722
        抗磷酸化eIF2α抗体Cell Signaling technology9721
        抗PERK抗体Cell Signaling technology3192
        抗IRE1α抗体Cell Signaling technology3294
        抗磷酸化Chk1（Ser348）抗体Cell Signaling2341
        抗HA抗体Cell Signalling3724
        抗GAPDH抗体Cell Signaling21185
        抗Abl抗体SigmaA5844
        抗磷酸化c-Abl（pTyr412）抗体SigmaC52490
        抗SMC1抗体Abcamab21583
        抗磷酸化SMC1（Ser957）抗体Abcamab137871
        抗KAP1抗体Abcamab190178
        抗磷酸化KAP1（Ser824）抗体Abcamab70369
        抗磷酸化ATM（Ser198）抗体MERK05-740
        抗p21抗体Santa Cruzsc-6246
        抗磷酸化p53抗体Cell Signalling9286 S
        抗p53抗体Santa Cruzsc-98
        抗p53抗体Santa Cruzsc-55476
        免疫荧光抗HA抗体Invitrogen715500
        抗磷酸化Chk1（Ser348）抗体Cell Signaling2341
        抗切割型caspase-3（Asp175）抗体Cell Signalling9661
        抗磷酸化S139-H2AX抗体Millipore05-636
        邻位连接试验抗HA抗体Biolegend901514
        抗HA抗体Abcam9110
        抗Abl抗体SigmaA5844
        体外RNA切割HiScribe T7高产RNA合成试剂盒New England Biolabs--
        体外寡聚化GST标记的IRE1α胞质结构域Sino Biologicals--
        His标记的c-AblCarna Biosciences--
        流式分析BD FACS Canto流式细胞仪Biosciences--

        关键环节

        汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

        环节核对要点
        DNA损伤诱导IRE1α激活
        依托泊苷浓度（10 μM或25 μM）和处理时间（8-16 h）；γ射线剂量（20-30 Gγ）；细胞类型（MEF）
        阅读提示：Methods细胞培养部分和Fig. 1图注
        RIDD活性检测
        依托泊苷浓度（10 μM）和处理时间（8-16 h）；实时PCR内参（Actin或Rpl19/Rpl32）；IRE1α抑制剂MKC-8866浓度（25 μM）
        阅读提示：Methods RNA部分和Fig. 1e、Fig. 3b图注
        细胞存活和凋亡检测
        依托泊苷、5-FU、HU浓度（1 μM或25 μM）和处理时间（24-36 h）；PI染色和流式分析；caspase-3阳性细胞计数
        阅读提示：Methods活力检测部分和Fig. 1f-i图注
        c-Abl与IRE1α相互作用
        伊马替尼浓度（10 μM）预处理1 h；依托泊苷10 μM处理8 h；共免疫沉淀和PLA条件
        阅读提示：Methods免疫沉淀和PLA部分及Fig. 4图注
        小鼠体内实验
        poly(I:C)注射方案（250 μg/次，3次，间隔2天）；依托泊苷50 mg/Kg或衣霉素1 mg/Kg腹腔注射；取材时间（6 h或48 h）；小鼠年龄（5-6周）
        阅读提示：Methods小鼠模型部分和Fig. 6图注
        果蝇体内实验
        依托泊苷浓度（100-500 μM）或多柔比星0.125 mg/mL；喂食时间（4 h或至成虫）；果蝇品系（UAS-Ire1 IR v39562等）
        阅读提示：Methods果蝇研究部分和Fig. 5图注

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