CRISPR基因编辑构建纤毛敲除hPSCs
构建完全缺乏纤毛的人多能干细胞系，以建立研究纤毛功能的模型。
利用CRISPR-Cas9系统在hPSCs中引入KIF3A或KIF3B的无效突变，生成多个突变细胞系和同源对照。
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利用基因敲除纤毛的人多能干细胞衍生的人类组织中模拟纤毛病表型
Modelling ciliopathy phenotypes in human tissues derived from pluripotent stem cells with genetically ablated cilia
实验完整度
高实验包括基因编辑、细胞培养、类器官分化、畸胎瘤形成、免疫印迹、RNA-seq及细胞外囊泡分析，涉及体外和体内模型，并有功能验证（如hedgehog通路调控）和机制验证。
主要模型
H9胚胎干细胞系 WTC11诱导多能干细胞系 KIF3A−/− hPSCs KIF3B−/− hPSCs 肾脏类器官 畸胎瘤
重点核对
KIF3A−/−和KIF3B−/− hPSCs完全丧失纤毛（ARL13B+和乙酰化α-微管蛋白+），但保持多能性和自我更新 肾脏类器官分化缺陷：KIF3A/B−/−产生类器官数量减少，神经元分化减少 Hedgehog信号异常：KIF3A/B−/−中GLI3R/GLI3F比值降低，GLI1表达升高，对SAG和环杷明无响应 细胞外囊泡释放异常：KIF3A/B−/−中EV内PC1、ARL13B、PTCH1等蛋白显著减少 囊肿形成：KIF3A/B−/−类器官中约50%形成囊肿，而对照组罕见
摘要
纤毛是与一系列人类疾病状态相关的天线状细胞器。纤毛的功能仍不完全清楚，特别是在人类中，细胞模型不能重现复杂的疾病。在这里，我们展示了通过CRISPR基因编辑产生的缺乏驱动蛋白-2亚基KIF3A或KIF3B的人类多能干细胞，建立了研究纤毛在组织形态发生中功能的通用工具。KIF3A−/−和KIF3B−/− hPSCs均缺乏纤毛，但仍能自我更新并保持多能性，从而能够高效衍生多种体细胞。衍生的组织和类器官表达模拟纤毛病谱系的多谱系表型，包括神经元和肾单位分化缺陷以及多囊肾病。模块化培养条件和生化分析揭示，人类纤毛在类器官分化过程中介导了hedgehog信号的关键转换，并组成性地释放含有与这些表型相关的信号分子的细胞外囊泡。因此，KIF3A−/−和KIF3B−/− hPSCs建立了一个将复杂纤毛表型与内源机制联系起来的人类遗传系统，用于治疗发现和再生应用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 纤毛在人类组织形态发生中的功能是什么，以及其缺失如何导致纤毛病表型？
- 核心机制
- 人类纤毛通过介导hedgehog信号从激活到抑制的关键转换，以及通过细胞外囊泡释放信号分子，调控组织分化和形态发生。
- 主要证据
- CRISPR基因编辑产生的KIF3A−/−和KIF3B−/− hPSCs缺乏纤毛，但保持多能性；肾脏类器官和畸胎瘤显示分化缺陷；免疫印迹显示GLI3加工异常和GLI1升高；EV分析显示关键信号分子释放减少。
- 研究意义
- 建立了一个新的通用工具，可研究纤毛在人类发育和疾病中的功能，为纤毛病和依赖纤毛的癌症提供治疗靶点和再生应用。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证hPSCs的纤毛缺失和多能性
确认基因编辑后细胞完全缺乏纤毛，同时保持自我更新和多能性特征。
通过免疫荧光检测纤毛标记物，评估细胞增殖、核型和分化能力。
畸胎瘤形成实验评估体内分化
评估无纤毛hPSCs在体内分化成多种组织的能力。
将hPSCs注射到免疫缺陷小鼠中形成畸胎瘤，分析组织组成和分化缺陷。
肾脏类器官分化
在体外模拟肾脏发育，评估纤毛缺失对肾单位形成的影响。
利用已建立的肾脏类器官分化方案，比较对照和突变体类器官的形成和分化。
Hedgehog信号通路分析
探究纤毛缺失对hedgehog信号通路的影响。
通过RNA-seq和免疫印迹检测GLI3、GLI1和PTCH1的表达和加工，比较突变体和对照。
细胞外囊泡分析和功能验证
检测纤毛缺失对细胞外囊泡释放的影响。
从hPSCs和肾脏类器官中纯化EV，分析关键蛋白的存在。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 基因编辑 | Lipofectamine Stem转染试剂 | Thermo Fisher | -- |
| FACS Aria细胞分选仪 | BD | -- | |
| QuickExtract DNA提取液 | Biocentre | -- | |
| 细胞培养 | mTeSR1培养基 | STEMCELL Technologies | -- |
| Geltrex基质胶 | Thermo Fisher | -- | |
| 环磷酸腺苷 | -- | -- | |
| 细胞活力检测 | alamarBlue细胞活力试剂 | Thermo Fisher | -- |
| 蛋白分析 | RIPA裂解液 | -- | -- |
| Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher | -- | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| PC1抗体 | Santa Cruz | sc-130554 | |
| PC2抗体 | Santa Cruz | sc-25749 | |
| KIF3A抗体 | Abcam | ab11259 | |
| KIF3B抗体 | Cell Signaling | 13817 | |
| β-肌动蛋白抗体 | Cell Signaling | 4970 | |
| FLOT1抗体 | Cell Signaling | 18634 | |
| IFT88抗体 | Proteintech | 13967-1-AP | |
| ARL13B抗体 | Proteintech | 17711-1-AP | |
| GLI1抗体 | Cell Signaling | 3538 | |
| GLI2抗体 | Abcam | ab26056 | |
| PTCH1抗体 | Cell Signaling | 8358 | |
| 免疫荧光 | 乙酰化α-微管蛋白抗体 | Sigma | T7451 |
| 乙酰化α-微管蛋白(D20G3)抗体 | Cell Signaling | -- | |
| AFP抗体 | R&D | MAB1368 | |
| SMA抗体 | R&D | MAB1420 | |
| ZO-1抗体 | Invitrogen | 339100 | |
| E-钙粘蛋白抗体 | Abcam | ab11512 | |
| Nephrin抗体 | R&D | AF4269 | |
| 磷酸化组蛋白H3抗体 | Santa Cruz | sc-8656-R | |
| OCT4抗体 | Abcam | ab19857 | |
| brachyury抗体 | Santa Cruz | sc-17745 | |
| SOX2抗体 | Abcam | ab97959 | |
| β-微管蛋白III(Tuj1)抗体 | Sigma-Aldrich | T2200-200UL | |
| 类器官分化 | Y27632 | Tocris Bioscience | -- |
| CHIR99021 | Stemgent | -- | |
| RPMI培养基 | Thermo Fisher | -- | |
| Glutamax | Thermo Fisher | -- | |
| 重组BMP-4 | Peprotech | -- | |
| B27 | Thermo Fisher | -- | |
| SAG | Cayman Chemical | -- | |
| 环杷明 | Cayman Chemical | -- | |
| 畸胎瘤形成 | Matrigel基质胶 | Corning | -- |
| RNA-seq | SMARTseq裂解液 | Clontech | -- |
| Illumina Nextera XT试剂盒 | Illumina | -- | |
| EV纯化 | 聚丙烯圆底试管 | Beckman | #355642 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CRISPR基因编辑 | KIF3A靶向序列（5'-CATATGGACAAACCGGAAC-3'）或KIF3B靶向序列（5'-TTCGCTGTCGGCCCATGAA-3'或5'-TACACCATGGAAGGAATCCG-3'）；细胞系（H9和WTC11）；转染试剂（Lipofectamine Stem） 阅读提示：Methods: Generation of gene-edited hPSCs |
| 细胞培养 | 使用mTeSR1培养基，5% CO2，每日换液；纤毛检测前使用100 μM cAMP处理48小时，最后24小时换成DMEM/F12 阅读提示：Methods: Pluripotent stem cell culture |
| 肾脏类器官分化 | CHIR99021浓度12 μM，处理时间36小时；RPMI培养基含Glutamax和BMP-4（2 ng/ml）；后续使用RB培养基，每3天换液 阅读提示：Methods: Kidney organoid differentiation |
| Hedgehog处理 | SAG浓度1 μM，环杷明浓度10 μM，从分化第1.5天开始持续处理 阅读提示：Methods: Kidney organoid differentiation（SAG和环杷明处理） |
| 畸胎瘤形成 | 免疫缺陷NOD-SCID小鼠，注射400,000个细胞，15周后收获 阅读提示：Methods: Teratoma formation |
| EV纯化 | 从1.5×10^6个细胞培养上清中收集，离心条件：2,000 g去除细胞碎片，17,000 g 4°C离心30分钟沉淀EV 阅读提示：Methods: EV Purification |