TALPID3和ANKRD26选择性调控FBF1定位与纤毛门控

TALPID3 and ANKRD26 selectively orchestrate FBF1 localization and cilia gating.

作者信息Hao Yan, Chuan Chen, Huicheng Chen, Hui Hong, Yan Huang, Kun Ling, Jinghua Hu, Qing Wei

PMID32366837

期刊Nat Commun

发布时间2020-05-04

DOI10.1038/s41467-020-16042-w

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实验完整度

高

秀丽隐杆线虫遗传模型与哺乳动物RPE细胞两个独立体系，含双突变体功能验证及GST pull-down、BiFC机制验证

主要模型

秀丽隐杆线虫野生型N2及talp-3、ankr-26、dyf-19突变体人视网膜色素上皮细胞hTERT RPE-1 HEK293T细胞

重点核对

talp-3; ankr-26双突变体与talp-3、ankr-26单突变体的纤毛表型及染料填充实验（n=300条虫，三次独立实验） TALP-3::GFP与TZ标志物MKS-5及TF标志物DYF-19、ANKR-26的共定位 talp-3; ankr-26双突变体中DYF-19::GFP向TFs的定位（n=36） RPE细胞中TALPID3和ANKRD26双敲低对FBF1在中心粒远端附属物定位的影响（n=300细胞，三次独立实验） RPE细胞血清饥饿24小时诱导纤毛形成及siRNA处理48小时

摘要

过渡纤维（TFs）调控纤毛门控，使初级纤毛成为独立的功能实体。然而，对功能性纤毛门控生物发生的分子机制仍知之甚少。在秀丽隐杆线虫的正向遗传筛选中，我们发现TALP-3——Joubert综合征蛋白TALPID3的同源物——是一个TF相关组分。遗传分析揭示TALP-3与ANKR-26（ANKRD26的同源物）协调以编排正确的纤毛门控。机制上，TALP-3和ANKR-26与关键门控组分DYF-19（FBF1的同源物）形成复合物。共敲低TALP-3和ANKR-26特异性损害DYF-19向TFs的招募。有趣的是，在哺乳动物细胞中，TALPID3和ANKRD26在协调FBF1向TFs的招募中也发挥保守作用。因此，我们报道了一个保守的蛋白模块，其特异性调控纤毛门控的功能组分，并提示门控缺陷与纤毛病发病机制之间的相关性。

鉴定TALP-3为TF相关组分

确定talp-3突变与纤毛形成缺陷的关系及其蛋白定位。

通过EMS正向遗传筛选获得jhu511等位基因，定位并克隆y57gllc.32（talp-3）；用染料填充实验、OSM-6::GFP和TBB-4::mCherry标记评估纤毛表型；用TALP-3::GFP与TZ和TF标志物共定位。

遗传相互作用分析

检验TALP-3与ANKR-26或DYF-19是否存在协同调控纤毛形成的关系。

构建talp-3; ankr-26和talp-3; dyf-19双突变体，用染料填充、TBB-4::mCherry、TEM和多种IFT标志物评估纤毛形成及门控。

验证膜受体纤毛门控

确定TALP-3和ANKR-26是否调控膜蛋白受体的纤毛导入。

在talp-3; ankr-26双突变体中检测GFP标记的PKD2、OSM-9和ODR-10的纤毛定位。

解析TALP-3-ANKR-26-DYF-19复合物

确定三蛋白的物理互作及TALP-3/ANKR-26对DYF-19定位的调控。

在talp-3; ankr-26双突变体中检测DYF-19::GFP定位；用GST pull-down检测体外直接互作；用BiFC检测活体线虫中复合物形成及突变体中的变化。

哺乳动物细胞中验证保守性

检验TALPID3和ANKRD26在哺乳动物细胞中对FBF1招募和纤毛门控的保守作用。

在RPE细胞中用siRNA敲低TALPID3和/或ANKRD26，免疫荧光检测纤毛形成、IFT140、FBF1、PKD2、Smo和Gli3定位；用3D-SIM分析TALPID3、ANKRD26和FBF1在中心粒的定位；用免疫共沉淀和GST pull-down验证互作。

实验环节	名称	品牌	货号
染料填充实验	DiI荧光亲脂性碳菁染料	Sigma-Aldrich	24364
GST pull-down	镍琼脂糖珠	GE Healthcare	--
GST琼脂糖珠	GE Healthcare	--
细胞培养与siRNA转染	Lipofectamine RNAiMAX转染试剂	Invitrogen	--
免疫荧光	抗乙酰化α-微管蛋白抗体	Sigma	T7451
抗γ-微管蛋白抗体	Sigma	T6557
抗FLAG抗体	Sigma	F1804
抗HA抗体	Sigma	H3663
抗CEP83抗体	Sigma	HPA038161
抗CEP164抗体	Sigma	SAB3500022
抗CEP290抗体	Abcam	ab84870
抗TALPID3抗体	Proteintech	24421-1-AP
抗ARL13b抗体	Proteintech	17711-1-AP
抗FBF1抗体	Proteintech	11531-1-AP
抗TCTN1抗体	Proteintech	15004-1-AP
抗SCLT1抗体	Proteintech	14875-1-AP
抗IFT140抗体	Proteintech	17460-1-AP
蛋白质印迹	抗β-肌动蛋白抗体	Santa Cruz	sc-47778
免疫荧光	抗SMO抗体	Santa Cruz	sc-166685
抗CEP89抗体	Abcam	ab204410
抗ANKRD26抗体	GeneTex	GTX128255
抗多聚谷氨酰化微管蛋白抗体	Enzo Life Sciences	ALX-804-885-C100
抗GLI-3抗体	R&D Systems	AF3690
抗ODF2抗体	Abnova	H00004957-M01
抗Polycystin-2抗体	Baltimore Polycystic Kidney Disease (PKD) Research and Clinical Core Center	--
免疫沉淀	Complete蛋白酶抑制剂混合物	Roche	--
PhosSTOP磷酸酶抑制剂混合物	Roche	--
透射电子显微镜	Hitachi H-7650电子显微镜	Hitachi	--

实验环节

名称

品牌

货号

染料填充实验

DiI荧光亲脂性碳菁染料

Sigma-Aldrich

24364

GST pull-down

镍琼脂糖珠

GE Healthcare

GST琼脂糖珠

GE Healthcare

细胞培养与siRNA转染

Lipofectamine RNAiMAX转染试剂

Invitrogen

免疫荧光

抗乙酰化α-微管蛋白抗体

Sigma

T7451

抗γ-微管蛋白抗体

Sigma

T6557

抗FLAG抗体

Sigma

F1804

抗HA抗体

Sigma

H3663

抗CEP83抗体

Sigma

HPA038161

抗CEP164抗体

Sigma

SAB3500022

抗CEP290抗体

Abcam

ab84870

抗TALPID3抗体

Proteintech

24421-1-AP

抗ARL13b抗体

Proteintech

17711-1-AP

抗FBF1抗体

Proteintech

11531-1-AP

抗TCTN1抗体

Proteintech

15004-1-AP

抗SCLT1抗体

Proteintech

14875-1-AP

抗IFT140抗体

Proteintech

17460-1-AP

蛋白质印迹

抗β-肌动蛋白抗体

Santa Cruz

sc-47778

免疫荧光

抗SMO抗体

Santa Cruz

sc-166685

抗CEP89抗体

Abcam

ab204410

抗ANKRD26抗体

GeneTex

GTX128255

抗多聚谷氨酰化微管蛋白抗体

Enzo Life Sciences

ALX-804-885-C100

抗GLI-3抗体

R&D Systems

AF3690

抗ODF2抗体

Abnova

H00004957-M01

抗Polycystin-2抗体

Baltimore Polycystic Kidney Disease (PKD) Research and Clinical Core Center

免疫沉淀

Complete蛋白酶抑制剂混合物

Roche

PhosSTOP磷酸酶抑制剂混合物

Roche

透射电子显微镜

Hitachi H-7650电子显微镜

Hitachi

环节	核对要点
秀丽隐杆线虫遗传模型构建	jhu511等位基因外显6次至N2背景；tm7883来源NBRP；dyf-19(jhu455)、hyls-1(tm3067)、gasr-8(gk1001)、k10g6.4(gk567)来源CGC或NBRP 阅读提示：Methods中C. elegans strains小节及Supplementary Table 1
染料填充实验	DiI终浓度（2 mg/ml母液1:200稀释于M9）、室温孵育2小时、n=300条虫三次独立实验阅读提示：Methods中Dye-filling assay小节及Fig. 1c、Fig. 2a图注
BiFC互作检测	BiFC质粒和MKS-5质粒各15 ng/μL，pRF4 100 ng/μL；YFP滤光片检测阅读提示：Methods中Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assay小节
GST pull-down	结合缓冲液组成（50 mM Tris-HCl pH 7.4、150 mM NaCl、1% Triton X-100、1 mM DTT、10%甘油、蛋白酶抑制剂）；4℃孵育4小时；洗涤5次阅读提示：Methods中GST pull-down assay小节
RPE细胞siRNA敲低与纤毛诱导	siRNA处理48小时；血清饥饿24小时诱导纤毛；siRNA序列；敲低效率验证阅读提示：Methods中Cell culture and siRNA小节、Fig. 6图注及Supplementary Fig. 7
哺乳动物细胞中心粒定位分析	甲醇−20℃固定用于中心粒染色；3D-SIM分析；TALPID3、ANKRD26、FBF1环直径测量样本数阅读提示：Methods中Microscopy and imaging小节及Fig. 5图注

环节

核对要点

秀丽隐杆线虫遗传模型构建

jhu511等位基因外显6次至N2背景；tm7883来源NBRP；dyf-19(jhu455)、hyls-1(tm3067)、gasr-8(gk1001)、k10g6.4(gk567)来源CGC或NBRP

阅读提示：Methods中C. elegans strains小节及Supplementary Table 1

染料填充实验

DiI终浓度（2 mg/ml母液1:200稀释于M9）、室温孵育2小时、n=300条虫三次独立实验

阅读提示：Methods中Dye-filling assay小节及Fig. 1c、Fig. 2a图注

BiFC互作检测

BiFC质粒和MKS-5质粒各15 ng/μL，pRF4 100 ng/μL；YFP滤光片检测

阅读提示：Methods中Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assay小节

GST pull-down

结合缓冲液组成（50 mM Tris-HCl pH 7.4、150 mM NaCl、1% Triton X-100、1 mM DTT、10%甘油、蛋白酶抑制剂）；4℃孵育4小时；洗涤5次

阅读提示：Methods中GST pull-down assay小节

RPE细胞siRNA敲低与纤毛诱导

siRNA处理48小时；血清饥饿24小时诱导纤毛；siRNA序列；敲低效率验证

阅读提示：Methods中Cell culture and siRNA小节、Fig. 6图注及Supplementary Fig. 7

哺乳动物细胞中心粒定位分析

甲醇−20℃固定用于中心粒染色；3D-SIM分析；TALPID3、ANKRD26、FBF1环直径测量样本数

阅读提示：Methods中Microscopy and imaging小节及Fig. 5图注

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