鉴定STAT1线性泛素化及HOIP的介导作用
验证STAT1是否发生线性泛素化并确定介导该修饰的E3连接酶。
通过质谱分析、免疫共沉淀、免疫荧光和Western blot检测HOIP与STAT1互作；利用shHOIP、HOIP敲除和LUBAC过表达检测STAT1线性泛素化。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
STAT1线性泛素化的调控控制抗病毒干扰素信号
Regulation of the linear ubiquitination of STAT1 controls antiviral interferon signaling.
实验完整度
高包含细胞模型、多种病毒感染的体外模型及HOIL-1L杂合和骨髓嵌合体小鼠体内模型，结构域突变和位点突变进行功能与机制验证。
主要模型
HEK293T、HeLa、2fTGH、HT1080、U3A等细胞系 VSV、SeV、HSV-1感染的体外细胞模型 Rbck1+/−（HOIL-1L杂合）小鼠模型 骨髓嵌合体小鼠模型
重点核对
STAT1线性泛素化位点Lys511和Lys652及K511R/K652R/K511/652R突变体的验证 HOIP敲低/敲除或LUBAC过表达对STAT1线性泛素化及IFN-I诱导的STAT1活化（pY701）的影响 IFNα/IFNβ处理时间（如30 min、4 h、20 h）及病毒（VSV MOI=0.1或0.5、SeV MOI=1.0）感染时间对STAT1线性泛素化和ISG表达的影响 Rbck1+/−小鼠中mIFNβ（1500 IU/g，i.p.，8 h）和VSV（1×10^8 PFU/g，i.p.，24 h）处理后的STAT1活化、ISG表达和病毒载量 骨髓嵌合体小鼠中GFP-STAT1-WT或K511/652R的体内IFN-I应答验证
摘要
线性泛素化是炎症信号通路的关键调控机制。然而，线性泛素化的底物及其生物学意义尚不完全清楚。本文中，我们发现在完整细胞中STAT1在Lys511和Lys652残基存在线性泛素化，这种修饰抑制STAT1与I型干扰素受体IFNAR2的结合，从而限制STAT1活化，导致I型干扰素信号稳态。I型干扰素刺激后，OTULIN迅速去除STAT1的线性泛素化，促进干扰素-STAT1信号的激活。此外，病毒通过NF-κB通路诱导HOIP表达，进而增加STAT1的线性泛素化，从而抑制干扰素抗病毒反应。因此，HOIL-1L杂合小鼠具有活跃的STAT1信号和对I型干扰素的增强应答。这些发现揭示了线性泛素化介导的I型干扰素信号稳态与激活之间的转换，并提示了临床抗病毒治疗的潜在策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- STAT1是否发生线性泛素化修饰，以及该修饰如何调控IFN-I诱导的STAT1信号和抗病毒活性。
- 核心机制
- STAT1在Lys511和Lys652发生HOIP介导的线性泛素化，该修饰阻断STAT1与IFNAR2结合，抑制STAT1活化；IFN-I刺激后OTULIN去除STAT1线性泛素化以促进STAT1活化；病毒感染通过NF-κB通路诱导HOIP表达，增加STAT1线性泛素化从而抑制IFN-I抗病毒反应。
- 主要证据
- 在HEK293T、HeLa、2fTGH等细胞中通过免疫共沉淀、Western blot和RT-qPCR验证STAT1线性泛素化位点、STAT1-IFNAR2互作、STAT1活化及ISG表达；在Rbck1+/−小鼠和骨髓嵌合体小鼠中验证STAT1线性泛素化对IFN-I抗病毒活性的体内调控。
- 研究意义
- 揭示了线性泛素化介导的I型干扰素信号稳态与激活之间的转换机制，并提示了临床抗病毒治疗的潜在策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证线性泛素化对STAT1信号和抗病毒功能的影响
确定STAT1线性泛素化对IFN-I诱导的STAT1活化、ISG表达和抗病毒活性的调控作用。
利用LUBAC过表达、HOIP敲低/敲除、ISRE双荧光素酶报告基因、RT-qPCR和病毒感染的细胞模型检测STAT1活化、ISG表达和病毒RNA水平。
确定STAT1线性泛素化位点及其功能
鉴定STAT1线性泛素化的关键赖氨酸残基并验证其对STAT1活化的影响。
将STAT1赖氨酸突变为精氨酸，通过免疫共沉淀检测线性泛素化水平；利用U3A（Stat1−/−）细胞和Stat1−/− MEF细胞回补STAT1-WT或K511/652R突变体，检测STAT1活化和抗病毒反应。
解析线性泛素化阻断STAT1与IFNAR2结合的机制
探究STAT1线性泛素化抑制STAT1活化的分子机制。
通过免疫共沉淀检测STAT1与JAK1、IFNAR2的相互作用；利用体外结合实验和体外激酶实验验证STAT1-DM与IFNAR2的结合及JAK1对STAT1的磷酸化。
验证OTULIN对STAT1线性泛素化的去除及IFN-I信号激活
确定IFN-I刺激后OTULIN去除STAT1线性泛素化并促进STAT1活化的作用。
通过免疫共沉淀检测OTULIN与STAT1互作及STAT1线性泛素化；利用shOTULIN或Flag-OTULIN过表达检测STAT1-IFNAR2结合、STAT1活化和ISG表达。
验证病毒诱导HOIP表达及STAT1线性泛素化的调控
确定病毒感染是否通过NF-κB通路上调HOIP并增加STAT1线性泛素化。
利用VSV或SeV感染细胞，检测HOIP mRNA和蛋白水平、STAT1线性泛素化及STAT1活化；使用NF-κB抑制剂PDTC处理。
体内验证STAT1线性泛素化对IFN-I抗病毒活性的调控
在动物水平验证STAT1线性泛素化对IFN-I信号和抗病毒活性的调控作用。
利用Rbck1+/−小鼠和骨髓嵌合体小鼠，检测STAT1线性泛素化、STAT1活化、ISG表达和病毒载量。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | HyClone | -- |
| 胎牛血清 | GIBCO, Life Technologies | -- | |
| 青霉素 | -- | -- | |
| 链霉素 | -- | -- | |
| 药物处理 | 重组人IFNα | PBL Interferon Source | -- |
| 重组小鼠IFNβ | R&D Systems | -- | |
| 重组人IFNβ | R&D Systems | -- | |
| IFNγ | R&D Systems | -- | |
| 质粒转染 | Flag多肽 | Sigma | F3290 |
| 嘌呤霉素 | Sigma | -- | |
| LongTrans转染试剂 | Ucallm | TF/07 | |
| GenePORTER2转染试剂 | Genlantis | T202015 | |
| QuickChange Lightning定点突变试剂盒 | Stratagene | 210518 | |
| 质谱分析 | 银染试剂盒 | Beyotime | P0017S |
| Orbitrap Elite杂交质谱仪 | Thermo Fisher | -- | |
| Dionex液相色谱 | Dionex | -- | |
| 免疫沉淀 | Protein G琼脂糖珠 | Millipore | #16-266 |
| Western blot | SuperSignal West Dura增强型化学发光试剂盒 | Thermo Scientific | -- |
| 抗pY-STAT1抗体 | Cell Signaling Technology | 9167 | |
| 抗线性泛素化抗体 | Millipore | MABS451 | |
| 抗p-JAK1抗体 | Cell Signaling Technology | 3331S | |
| 抗p-Tyk2抗体 | Cell Signaling Technology | 9321 | |
| 抗Flag抗体 | Sigma | F7425 | |
| 抗HA抗体 | Abcam | ab9110 | |
| 抗JAK1抗体 | Santa Cruz | sc-1677 | |
| 抗Tyk2抗体 | Cell Signaling Technology | 14193 | |
| 抗STAT1抗体 | Cell Signaling Technology | 9172 | |
| 抗p-STAT2抗体 | Santa Cruz | sc-21689-R | |
| 抗STAT2抗体 | Santa Cruz | sc-1668 | |
| 抗Myc抗体 | Abmart | M20002H | |
| 抗VSV-G抗体 | Santa Cruz | sc-66180 | |
| 抗β-Actin抗体 | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| 抗Tubulin抗体 | Proteintech | 66031-1-Ig | |
| 抗RBCK1抗体 | SIGMA | M11547 | |
| 抗Lamb1抗体 | Proteintech | 12987-1-AP | |
| 抗泛素抗体 | Santa Cruz | 12987-1-AP | |
| 抗OTULIN抗体 | Cell Signaling Technology | 14127 | |
| 抗IFN-α/βRβ (D-6)抗体 | Santa Cruz | sc-271105 | |
| 抗STAT1抗体 | Santa Cruz | sc-464 | |
| 抗IFIT1抗体 | Cell Signaling Technology | 14769 | |
| 抗HOIP抗体 | Abcam | ab125189 | |
| 抗PKR抗体 | Cell Signaling Technology | 3072 | |
| RNA提取与RT-qPCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| RevertAid第一链cDNA合成试剂盒 | Thermo | K1622 | |
| SYBR Green预混液 | BIO-RAD | -- | |
| StepOne Plus实时PCR系统 | Applied Bioscience | -- | |
| 报告基因实验 | 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | #E1910 |
| 免疫荧光 | Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG | Alexa Fluor | A11001 |
| Alexa Fluor 594山羊抗兔IgG | Alexa Fluor | A11012 | |
| DAPI | -- | -- | |
| Nikon A1共聚焦显微镜 | Nikon | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| STAT1线性泛素化位点鉴定 | STAT1突变位点：K511R、K652R、K511/652R（DM）；所用细胞系：U3A（Stat1−/−）和HEK293T；转染质粒：Myc-STAT1-WT或突变体、HA-K0 阅读提示：Methods“Plasmids and transfection”及图3c、3e、3g图注 |
| IFN-I诱导的STAT1活化检测 | IFNα或IFNβ浓度（1000 IU/ml）、处理时间（如30 min、4 h、20 h）；检测指标：pY701-STAT1 Western blot、ISRE双荧光素酶活性、ISG mRNA RT-qPCR 阅读提示：图2c–j、图3h–k、图5i–k图注及Methods“Reporter gene assay” |
| 病毒感染的体外抗病毒实验 | 病毒类型（VSV、SeV、HSV-1）、感染滴度（VSV MOI=0.1或0.5；SeV MOI=1.0；HSV-1 MOI=0.1或1.0）、感染时间（如24 h）；IFNα预处理浓度（60 IU/ml）和时间（过夜） 阅读提示：Methods“Viruses and viral infection in vitro”及图2i、2j、5k、6f、6g图注 |
| 小鼠体内IFN-I应答和抗病毒实验 | 小鼠基因型（Rbck1+/+或Rbck1+/−，C57BL/6背景，6-8周龄）；mIFNβ剂量（1500 IU/g，i.p.）和处理时间（8 h）；VSV剂量（1×10^8 PFU/g，i.p.）和感染时间（24 h）；样本量（每组6只小鼠） 阅读提示：Methods“Interferon-β administration in vivo”和“Viral infection in vivo”及图7b–e图注 |
| 骨髓嵌合体实验 | 受体小鼠（BALB/c，650 cGy照射）；供体小鼠（Stat1−/−，129S6）；骨髓细胞感染慢病毒（GFP-STAT1-WT或K511/652R）；注射细胞数（1×10^7，i.v.）；mIFNβ剂量（1500 IU/g，i.p.）和处理时间（8 h） 阅读提示：Methods“Bone marrow chimeras”及图8a–c图注 |