鉴定HOXB13调控的基因和通路
确定HOXB13 KD对基因表达的影响及功能富集
在LNCaP细胞中建立对照、HOXB13 KD、KD后回补WT或G84E突变体的稳定细胞系，进行RNA-seq和GO分析。
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HOXB13通过HDAC3介导的表观遗传重编程抑制前列腺癌中的从头脂肪生成
HOXB13 suppresses de novo lipogenesis through HDAC3-mediated epigenetic reprogramming in prostate cancer
实验完整度
高包含体外细胞实验（LNCaP、22Rv1、C4-2B、PC-3等）、患者来源异种移植模型（LuCaP PDX）、基因编辑、转录组与表观基因组分析及体内移植瘤模型，并进行了功能验证（脂质积累、细胞侵袭、转移）及机制验证（HDAC3相互作用、组蛋白去乙酰化）。
主要模型
LNCaP细胞系 PC-3和PC-3M细胞系 C4-2B细胞系 22Rv1细胞系及同源G84E突变体 LuCaP患者来源异种移植模型 PC-3M原位和静脉异种移植小鼠模型
重点核对
HOXB13 KD在LNCaP及PC-3等细胞中导致FASN、SREBF1/2等脂肪生成基因的上调 HDAC3抑制剂或敲低HDAC3对HOXB13介导的脂肪生成抑制的影响 HOXB13 G84E突变对HOXB13-HDAC3相互作用及脂肪生成抑制的影响 体内移植瘤模型中TVB-2640对HOXB13 KD驱动的转移的抑制作用 HOXB13基因甲基化状态与CRPC中HOXB13表达的关系
摘要
HOXB13是一种同源域转录因子，关键调节雄激素受体（AR）活性和雄激素依赖性前列腺癌（PCa）的生长。然而，其在AR非依赖情境中的功能仍不清楚。在此我们报告HOXB13与组蛋白去乙酰化酶HDAC3的相互作用，该作用被HOXB13 G84E突变破坏，该突变与早发性PCa相关。独立于AR，HOXB13将HDAC3招募至脂肪生成增强子，催化组蛋白去乙酰化并抑制脂肪生成调节因子如脂肪酸合酶（FASN）。对人类组织的分析显示，约30%的转移性去势抵抗性PCa中HOXB13基因高度甲基化并下调。HOXB13缺失或G84E突变导致PCa细胞脂质积累，从而促进细胞运动和异种移植瘤转移，而通过药物抑制FASN可减轻这些效应。总之，我们提供的证据表明HOXB13招募HDAC3抑制从头脂肪生成并抑制肿瘤转移，脂肪生成通路抑制剂可能有助于治疗HOXB13低表达的PCa。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- HOXB13在AR非依赖情境下的功能及其在去势抵抗性前列腺癌（CRPC）中的作用机制是什么？
- 核心机制
- HOXB13通过其MEIS结构域与HDAC3相互作用，招募HDAC3至脂肪生成增强子，催化组蛋白去乙酰化，抑制FASN等脂肪生成调节因子的表达，从而抑制从头脂肪生成和肿瘤转移。G84E突变破坏该相互作用，导致脂肪生成增加和转移。
- 主要证据
- 在LNCaP等细胞中，HOXB13 KD上调脂肪生成基因，此效应可被WT但非G84E突变体回补；ChIP-seq显示HOXB13与HDAC3共占据位点，KD减少HDAC3募集并增加H3K27ac；体内PC-3M异种移植瘤中HOXB13 KD促进转移，TVB-2640抑制该效应。
- 研究意义
- 该研究揭示HOXB13在AR非依赖情境中的肿瘤抑制功能，并提示FASN抑制剂TVB-2640可能用于治疗HOXB13低表达的前列腺癌。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证HOXB13对脂肪生成基因的直接调控
确认HOXB13直接结合脂肪生成基因增强子并调控其表达
进行HOXB13 ChIP-seq、ChIP-qPCR，结合RNA-seq用BETA预测激活/抑制功能；在多种细胞系中验证FASN等基因的调控。
鉴定HOXB13的相互作用蛋白HDAC3
寻找HOXB13抑制脂肪生成的辅助因子
通过串联亲和纯化-质谱鉴定HOXB13相互作用蛋白，Co-IP验证HDAC1/3、NCoR1/2等，并定位相互作用结构域。
验证HDAC3介导的组蛋白去乙酰化
验证HOXB13招募HDAC3导致脂肪生成增强子处组蛋白去乙酰化
ChIP-seq分析HOXB13 KD后HDAC3结合和H3K27ac变化，ChIP-qPCR验证；在PDX模型中检查。
验证HDAC3在HOXB13介导的脂肪生成抑制中的必要性
证明HDAC3为HOXB13抑制脂肪生成所必需
在HDAC3 KD背景下检测HOXB13 OE对脂肪生成基因和脂质积累的影响；进行脂质组学和Oil Red O染色。
分析CRPC中HOXB13启动子甲基化和表达
评估HOXB13在CRPC中的表达和表观遗传调控
分析TCGA等公共数据HOXB13表达和甲基化；通过IHC检测CRPC TMA；在细胞中过表达DNMT3A/EZH2验证抑制。
评估HOXB13缺失对细胞运动和转移的影响
确定HOXB13缺失是否促进迁移和转移
细胞侵袭和迁移实验；原位和静脉移植瘤模型，IVIS监测转移；检测Alu序列和脂质积累。
验证FASN抑制剂TVB-2640的治疗效果
测试FASN抑制剂能否抑制HOXB13低表达肿瘤的生长和转移
在静脉移植瘤模型中，用TVB-2640处理HOXB13 KD或对照细胞，评估转移和生存期；检测FASN表达和脂质积累。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
蛋白检测
统计分析
DNA甲基化分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI1640培养基 | -- | -- |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 角质形成细胞无血清培养基 | -- | -- | |
| 脂质染色 | 油红O | Sigma | O0625 |
| 药物处理 | TVB-2640 | TargetMol | T15271 |
| TOFA | Cayman Chemical | 54857-86-2 | |
| 辛伐他汀 | Cayman Chemical | 79902-63-9 | |
| 载体构建 | Q5定点突变试剂盒 | NEB | E0554S |
| lentiCRISPR v2载体 | Addgene | 52961 | |
| pLKO.1-TRC载体 | Addgene | 10878 | |
| dCas9-SunTag | Addgene | 122151 | |
| scFv-sfGFP-DNMT3A1 | Addgene | 102278 | |
| pLKO5.sgRNA.EFS.tRFP657 | Addgene | 57824 | |
| 细胞培养 | 嘌呤霉素 | -- | -- |
| 聚凝胺 | -- | -- | |
| 蛋白质分析 | 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | -- |
| 免疫共沉淀 | Dynabeads Protein G磁珠 | Life Technologies | -- |
| 质谱分析 | 链霉亲和素偶联磁珠 | GE Healthcare | -- |
| S蛋白磁珠 | EMD Millipore | -- | |
| Orbitrap Velos Pro质谱仪 | Thermo Scientific | -- | |
| RNA提取 | NucleoSpin RNA提取试剂盒 | Takara | -- |
| RT-qPCR | ReverTra Ace qPCR RT预混液 | Diagnocine | -- |
| Bullseye EvaGreen qPCR预混液 | MIDSCI | -- | |
| StepOne Plus实时荧光定量PCR仪 | Applied Biosystems | -- | |
| RNA-seq | NEBNext Ultra RNA文库制备试剂盒 | NEB | -- |
| 文库定量试剂盒 | Kapa Biosystems | KK4603 | |
| ChIP-seq | E220聚焦超声破碎仪 | Covaris | -- |
| NEBNext Ultra II DNA文库制备试剂盒 | NEB | E7645S | |
| Agencourt AMPure XP磁珠 | Beckman Coulter | -- | |
| ChIP-qPCR | DNA清洁与浓缩-5试剂盒 | ZYMO Research | -- |
| ATAC-seq | Tn5转座酶 | Illumina | -- |
| 毛地黄皂苷 | Promega | G9441 | |
| 脂质染色 | 脂质（油红O）染色试剂盒 | Biovision | K580-24 |
| 脂肪酸摄取 | 脂肪酸摄取检测试剂盒 | Biovision | K408 |
| 脂蛋白去除胎牛血清 | Kalen biomedical | 880100-1 | |
| 脂质检测 | LipidSpot 610脂滴染色试剂盒 | Biotium | 70069-T |
| 动物成像 | D-荧光素 | Goldbio | -- |
| Lago生物发光/荧光成像系统 | Spectral Instruments Imaging | -- | |
| Alu-qPCR | TaqMan通用PCR预混液 | Fisher | 4364338 |
| 免疫组织化学 | SIGMAFAST DAB显色试剂盒 | MilliporeSigma | -- |
| 抗HOXB13抗体 | Cell Signaling Technology | 90944 | |
| 抗FASN抗体 | Bethyl | A301-323A | |
| 广谱角蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 4545 | |
| 荧光素酶抗体 | Novus | NB100-1677 | |
| 图像分析 | Image J软件 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源、培养基、血清浓度、培养条件 阅读提示：Methods - Cell lines |
| 基因敲低与过表达 | shRNA序列、靶序列、病毒包装和感染条件、筛选浓度 阅读提示：Methods - Constructs and Lentivirus |
| ChIP-seq和ChIP-qPCR | 细胞数量、抗体、甲醛交联时间、超声条件、洗涤条件 阅读提示：Methods - ChIP, ChIP-seq, and ATAC-seq |
| 细胞侵袭实验 | 细胞数量、基质胶、胎牛血清浓度、培养时间 阅读提示：Methods - Cell invasion and colony formation assay |
| 脂质染色 | 染色试剂盒、步骤、定量方法 阅读提示：Methods - Lipidomic analysis and oil red O staining |
| 动物模型 | 小鼠品系、周龄、细胞接种数量、注射部位、TVB-2640剂量与给药方案 阅读提示：Methods - Murine orthotopic and intravenous xenograft studies |
| 免疫组化 | 抗体稀释度、抗原修复方法、评分标准 阅读提示：Methods - Tissue acquisition and tissue microarray analysis |