建立原代肝细胞胶原三明治培养模型并评估Tjp1敲除对节律的影响
验证TJP1对肝细胞昼夜节律振幅的自主调控作用。
小鼠原代肝细胞在胶原三明治（SD+）或普通培养（SD−）下，用地塞米松同步化后不同时间点收样，检测Rev-Erbα表达和节律振幅；通过免疫染色和TER评估紧密连接形成。
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紧密连接蛋白TJP1调控进食调节的肝脏昼夜节律
The tight junction protein TJP1 regulates the feeding-modulated hepatic circadian clock.
实验完整度
高包含原代肝细胞、多种基因敲除小鼠模型、Co-IP、体外激酶实验及在体功能验证
主要模型
原代小鼠肝细胞（胶原三明治培养） 肝脏特异性Tjp1敲除小鼠 肝脏特异性Raptor敲除小鼠 肝脏特异性Tsc1敲除小鼠
重点核对
原代肝细胞胶原三明治培养与地塞米松同步化（0.1 μM） 氨基酸刺激和Torin1处理（250 nM）的时序与浓度 小鼠禁食（ZT12至ZT4）再喂食（2小时）方案 腺病毒尾静脉注射剂量（5×10^8 pfu/小鼠） 高胰岛素-正葡萄糖钳实验的胰岛素输注速率（6 mU kg−1 min−1）
摘要
哺乳动物视交叉上核和外周组织中的昼夜节律钟协调行为和生理活动以响应环境线索。在肝脏中，昼夜节律钟也受进食调节。然而，所涉及的分子机制尚不清楚。在此，我们展示TJP1（紧密连接蛋白1）作为mTOR（雷帕霉素机制靶点）的介导者调节肝脏昼夜节律钟。TJP1与PER1（period昼夜节律调节因子1）相互作用并阻止其核转位。在进食过程中，mTOR磷酸化TJP1并减弱其与PER1的结合，从而增强PER1的核穿梭以抑制昼夜节律振荡。因此，我们的结果提供了关于进食如何调节肝脏昼夜节律钟的前所未有的机制见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 进食调节肝脏昼夜节律钟的分子机制是什么？
- 核心机制
- 进食激活mTOR，mTOR磷酸化TJP1，破坏TJP1与PER1的相互作用，促进PER1核转位，从而抑制CLOCK:BMAL1靶基因表达，减弱昼夜节律振幅。
- 主要证据
- 在原代肝细胞和肝脏特异性敲除小鼠中，通过Co-IP、免疫印迹、免疫荧光和体内激酶实验证明mTOR磷酸化TJP1并调控PER1核转位；再喂食实验显示该通路介导进食对节律的调节。
- 研究意义
- 提供了进食如何调节肝脏昼夜节律钟的机制解释，并将紧密连接复合体与昼夜节律联系起来；TJP1缺失改善胰岛素敏感性，提示昼夜节律振幅与胰岛素抵抗之间的潜在分子联系。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
肝脏特异性Tjp1敲除小鼠的节律表型分析
在体内验证TJP1对肝脏昼夜节律的调控。
利用Alb-Cre构建Tjp1 LKO小鼠，检测肝脏和SCN中E-box基因表达，以及PER1/CRY1的核转位。
鉴定TJP1与PER1的相互作用及mTOR的调控
明确TJP1是否与PER1结合以及mTOR是否调节该结合。
免疫共沉淀联合质谱鉴定TJP1相互作用蛋白；氨基酸和Torin1处理原代肝细胞，检测TJP1:PER1结合及PER1核转位；体外激酶实验验证mTOR磷酸化TJP1。
验证TJP1磷酸化对PER1核转位的影响
确定mTOR磷酸化TJP1是否足以促进PER1核转位。
在Tjp1 LKO小鼠中腺病毒表达TJP1野生型、6A（磷酸化缺陷）或6D（磷酸化模拟）突变体，检测PER1核转位和Rev-Erbα表达。
验证mTOR对肝脏昼夜节律的调控
检验mTOR活性变化是否影响肝脏节律振幅。
使用Torin1处理或Raptor LKO、Tsc1 LKO小鼠，检测Rev-Erbα表达、节律振幅和PER1核转位。
验证进食通过mTOR-TJP1轴调节PER1核转位
在生理性进食状态下验证mTOR-TJP1通路的作用。
小鼠禁食（ZT12至ZT4）再喂食2小时，检测WT、Raptor LKO、Tsc1 LKO和Tjp1 LKO小鼠中PER1核转位和Rev-Erbα表达。
验证TJP1介导mTOR对进食调节节律的作用
确定TJP1是mTOR调控肝脏节律的关键下游介质。
构建Raptor/Tjp1双敲除小鼠，以及在Tsc1 LKO背景下表达TJP1/6A突变体，检测PER1核转位和Rev-Erbα表达。
评估TJP1缺失对胰岛素敏感性的影响
探究TJP1缺失是否改善代谢表型。
Tjp1 LKO小鼠喂食常规饮食或高脂饮食16周，进行高胰岛素-正葡萄糖钳实验，检测血糖、胰岛素、甘油三酯等指标。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 地塞米松 | -- | -- |
| Torin1 | -- | -- | |
| 氨基酸混合物 | Sigma | M5550 | |
| 胶原溶液 | BD Biosciences | -- | |
| RPMI1640培养基 | -- | -- | |
| M199培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | HyClone | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 支原体检测试剂盒 | Sigma | MP0035 | |
| 亚细胞组分分离 | 溶酶体分离试剂盒 | Sigma | LYSISO1 |
| 跨上皮电阻测定 | Transwell小室 | Corning | CLS3450-24EA |
| 电阻测量系统 | Millipore | MERS00002 | |
| 免疫共沉淀 | HA磁珠 | Thermo | 26182 |
| 抗mCherry抗体 | Origene | TA180028 | |
| 抗TJP1抗体 | Invitrogen | 61-7300 | |
| Protein A/G Plus琼脂糖 | Thermo | 26161 | |
| 蛋白质印迹 | BCA蛋白测定试剂盒 | Thermo Fisher | 23227 |
| 抗PER1抗体 | ABclonal | A8449 | |
| 抗PER2抗体 | ABclonal | A13168 | |
| 抗CRY1抗体 | ABclonal | A6890 | |
| 抗CLDN1抗体 | ABclonal | A2196 | |
| 抗LAMP1抗体 | ABclonal | A2582 | |
| 抗LMNA抗体 | ABclonal | A0249 | |
| 抗肌动蛋白抗体 | Proteintech | 66009 | |
| 抗BMAL1抗体 | Proteintech | 14268-1-AP | |
| 抗Rev-Erbα抗体 | Proteintech | 14506-1-AP | |
| 抗Cingulin抗体 | Proteintech | 21369-1-AP | |
| 抗V5抗体 | Proteintech | 66007-1-Ig | |
| 兔抗TJP1抗体 | Thermo Fisher | 61-7300 | |
| 鼠抗TJP1抗体 | Thermo Fisher | 339100 | |
| 抗TJP2抗体 | Thermo Fisher | 374700 | |
| 大鼠抗TJP1抗体 | Millipore | MABT11 | |
| 抗CLOCK抗体 | Cell Signaling Technology | 5157S | |
| 抗S6K抗体 | Cell Signaling Technology | 2708 | |
| 抗磷酸化S6K抗体 | Cell Signaling Technology | 9234 | |
| 抗mTOR抗体 | Cell Signaling Technology | 2983 | |
| 抗RAPTOR抗体 | Cell Signaling Technology | 2280T | |
| 抗EEA1抗体 | Cell Signaling Technology | 3288 | |
| 抗TSC1抗体 | Cell Signaling Technology | 6935S | |
| 抗TJP3抗体 | Cell Signaling Technology | 3704 | |
| 抗KDEL抗体 | Abcam | ab12223 | |
| 抗COX IV抗体 | Abcam | ab33985 | |
| 抗TGN46抗体 | Abcam | ab50595 | |
| 抗mCherry抗体 | Origene | TA180028 | |
| 抗LAMP1抗体 | Sigma-Aldrich | L1418 | |
| 抗微管蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | T6199 | |
| 抗FLAG抗体 | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| 抗GFP抗体 | COVANCE | MMS-118P | |
| 抗HA抗体 | COVANCE | MMS-101P | |
| 抗His抗体 | MBL | D291-3 | |
| 磷酸化S1614 TJP1抗体 | Beijing Prorevo Biotech Co. Ltd. | -- | |
| 体外激酶实验 | 截短型mTOR | Millipore | 14-770 |
| 蛋白纯化 | 镍亲和树脂 | QIAGEN | -- |
| Superdex 200凝胶过滤柱 | GE Healthcare | -- | |
| RNA提取与qPCR | 总RNA纯化试剂盒 | GeneMark | -- |
| RevertAid第一链cDNA合成试剂盒 | Thermo | -- | |
| LightCycler 480 II实时PCR仪 | Roche | -- | |
| 代谢指标检测 | 自动血糖仪 | LifeScan | -- |
| 甘油三酯检测试剂盒 | Sigma | TR0100 | |
| 胆固醇检测试剂盒 | Cayman | 10007640 | |
| 胰岛素ELISA试剂盒 | Mercodia | 10-1247-01 | |
| 游离脂肪酸检测试剂盒 | Wako | 294-636 | |
| 总胆汁酸试剂盒 | Diazyme | DZ092A | |
| PhenoMaster代谢监测系统 | TSE Systems | -- | |
| EchoMRI体成分分析仪 | EchoMRI | -- | |
| 高胰岛素-正葡萄糖钳实验 | [6,6-2H]葡萄糖 | -- | -- |
| Q Exactive质谱仪 | Thermo | -- | |
| ultimate 3000超高效液相色谱 | Thermo | -- | |
| 质谱分析 | LTQ Orbitrap质谱仪 | Thermo | -- |
| 免疫荧光 | 落射荧光显微镜 | Zeiss | -- |
| 透射电子显微镜 | Tecnai Spirit 120 kV透射电子显微镜 | Tecnai | -- |
| 腺病毒包装 | PfuUltra II Fusion HS DNA聚合酶 | Agilent | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 原代肝细胞分离与胶原三明治培养 | 胶原浓度（1 mg/ml）、肝细胞接种密度（3×10^6/10 cm dish）、地塞米松同步化浓度（0.1 μM）及收样时间点 阅读提示：Methods中Cell culture和Collagen gel sandwich cultures小节；Fig. 1a图注 |
| 氨基酸刺激与Torin1处理 | 无氨基酸RPMI1640孵育时间（6小时或过夜）、Torin1浓度（250 nM）及预处理时间（30分钟或1小时）、氨基酸刺激时间（30分钟） 阅读提示：Methods中Cell culture小节；Fig. 2a和2b图注 |
| 小鼠禁食再喂食实验 | 禁食时间窗（ZT12至ZT4）、再喂食时长（2小时）、取材时间点（ZT6）、小鼠年龄（8–12周）和性别（雄性） 阅读提示：Methods中Mouse experiments小节；Fig. 5图注 |
| 腺病毒尾静脉注射 | 腺病毒剂量（5×10^8 pfu/小鼠）、注射体积和表达时间 阅读提示：Methods中Mouse experiments和Plasmids and adenoviruses小节 |
| 高胰岛素-正葡萄糖钳实验 | 胰岛素输注速率（6 mU kg−1 min−1）、[6,6-2H]glucose输注方案（初始600 μg kg−1，持续30 μg kg−1 min−1）、血糖目标（100±5 mg/dl）、采样时间点（t=−10, 0, 110, 120 min） 阅读提示：Methods中Hyperinsulinemic-euglycemic clamps小节 |
| 肝脏特异性基因敲除小鼠构建 | Tjp1 LKO（Alb-Cre，删除外显子3）、Raptor LKO（腺病毒-Cre，1×10^9 pfu）、Tsc1 LKO（Alb-Cre）的构建策略和对照设置 阅读提示：Methods中Mouse strains小节 |