宿主CBS/H2S在Mtb感染中的作用
验证Mtb感染是否改变宿主CBS表达及H2S水平，并评估CBS缺失对细菌载量和生存的影响。
用Mtb H37Rv感染RAW 264.7巨噬细胞和小鼠腹腔巨噬细胞，检测CBS蛋白水平；用Cbs+/−和野生型小鼠进行Mtb感染，检测肺和脾的细菌载量、生存期及病理变化。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
硫化氢刺激结核分枝杆菌的呼吸、生长和致病性
Hydrogen sulfide stimulates Mycobacterium tuberculosis respiration, growth and pathogenesis.
实验完整度
高包含Cbs+/−小鼠感染模型、巨噬细胞体外感染、Mtb呼吸与代谢分析、转录组及基因突变株验证，并有功能与机制验证
主要模型
Cbs+/−小鼠与野生型小鼠Mtb感染模型 小鼠腹腔巨噬细胞 Mtb H37Rv及cydC::aph、ΔdosS、ΔdosT等突变株 耻垢分枝杆菌和牛分枝杆菌BCG
重点核对
Cbs+/−小鼠与野生型小鼠在Mtb感染后的生存期、肺和脾的细菌载量 GYY4137浓度（5、10、25、50、100 µM）对Mtb生长、ATP和OCR的双相效应 Mtb cydC::aph突变株中GYY4137对OCR和生长的刺激作用减弱 AOAA（13 mg/kg，每周6天，共6周）和GYY4137（25 mg/kg，每周3天，共6周）腹腔给药对小鼠肺部细菌载量的影响 RNA-seq中25 µM GYY4137处理1小时后差异表达基因及Dos调节子诱导
摘要
硫化氢（H2S）参与众多病理生理过程，并与CO和•NO具有重叠功能。然而，宿主来源的H2S在微生物致病性中的重要性尚不清楚。本研究表明，感染结核分枝杆菌（Mtb）的缺乏H2S生成酶胱硫醚β-合酶（CBS）的小鼠存活时间更长且器官负荷降低，并且药理学抑制CBS可减少小鼠体内的Mtb细菌载量。高分辨率呼吸测量、转录组学和质谱分析证实，H2S主要通过细胞色素bd氧化酶刺激Mtb的呼吸和生物能量学，并且H2S可逆转•NO对Mtb呼吸的抑制作用。此外，将Mtb暴露于H2S会调控参与硫和铜代谢的基因以及Dos调节子。我们的结果表明，Mtb利用宿主来源的H2S促进生长和疾病，并提示靶向H2S产生的宿主导向疗法可能对结核病和其他微生物感染的管理具有潜在用途。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 宿主来源的H2S是否通过调节Mtb的呼吸和生物能量学在结核病中发挥作用。
- 核心机制
- H2S主要通过细胞色素bd氧化酶刺激Mtb呼吸和生物能量学，并逆转•NO对Mtb呼吸的抑制，从而促进Mtb生长和疾病。
- 主要证据
- Cbs+/−小鼠感染后存活延长、器官负荷降低；GYY4137剂量依赖性刺激Mtb生长、ATP和OCR；cydC::aph突变株中刺激作用减弱；转录组显示硫/铜代谢基因和Dos调节子上调。
- 研究意义
- 结果表明Mtb利用宿主来源的H2S促进生长和疾病，提示靶向H2S产生的宿主导向疗法可能对结核病和其他微生物感染的管理具有潜在用途。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
H2S对Mtb生长和生物能量学的直接效应
验证H2S是否直接调节Mtb生长、ATP水平和呼吸。
用H2S供体GYY4137和NaHS处理Mtb，检测CFU、ATP水平和OCR；用LC-MS/MS检测代谢物；用13C标记进行碳追踪分析。
细胞色素bd氧化酶介导H2S的呼吸刺激效应
确定H2S刺激Mtb呼吸是否主要通过CytBD。
使用Mtb cydC::aph突变株（CytBD缺陷）和互补株，检测GYY4137对OCR、ATP和生长的影响；用耻垢分枝杆菌和KCN处理区分aa3型氧化酶和CytBD。
H2S对Mtb转录组和Dos调节子的调控
分析H2S对Mtb基因表达的影响及Dos调节子诱导是否依赖DosS/DosT。
对Mtb和cydC::aph进行RNA-seq；用qRT-PCR检测WT、ΔdosS、ΔdosT和ΔdosST突变株中Dos调节子基因表达。
H2S在低氧和氧化应激条件下的作用
评估H2S是否促进Mtb进入低氧休眠及抵抗氧化应激。
用甲硝唑处理检测GYY4137暴露后Mtb在低氧下的存活；进行8周低氧和再氧合恢复实验；用CHP和MND氧化应激检测存活率；用DHE检测ROS。
H2S与•NO的交互作用及CBS药理抑制的体内验证
验证H2S是否逆转•NO对Mtb呼吸的抑制，以及药理学调节CBS是否改变小鼠感染结局。
用•NO供体DETA/NO和GYY4137处理Mtb检测OCR、ATP和CFU；在巨噬细胞和小鼠中使用CBS抑制剂AOAA和GYY4137，检测细菌载量和血清硫化物水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| H2S供体处理 | GYY4137 | Cayman Chemicals | -- |
| 细菌培养 | Middlebrook 7H9肉汤 | Difco | -- |
| BBL 7H11琼脂 | BD Biosciences | -- | |
| 免疫印迹 | 抗CBS抗体 | Santa Cruz | sc-67154 |
| 抗3-MST抗体 | Abcam | ab85377 | |
| 抗CSE抗体 | Proteintech | 12217-1-AP | |
| 抗GAPDH抗体 | Santa Cruz | sc-25778 | |
| 抗iNOS抗体 | Abcam | ab3523 | |
| 过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗 | Abcam | ab6721 | |
| 流式细胞术 | Ly-6G (Gr-1) APC抗体 | eBioscience | 17-9668-82 |
| CD11b eVolve 605抗体 | eBioscience | 83-0112-42 | |
| F4/80抗原APC-eFluor 780抗体 | eBioscience | 47-4801-82 | |
| CD4 eVolve 605抗体 | eBioscience | 83-0042-42 | |
| CD45.2-Bv650抗体 | BioLegend | 109836 | |
| IFN-γ-APC抗体 | BioLegend | 505810 | |
| BD固定/透化试剂盒 | BD Biosciences | -- | |
| 细胞因子分析 | Bio-Plex Pro小鼠细胞因子17重检测试剂盒 | Bio-Rad | -- |
| 呼吸测量 | XF96细胞外通量分析仪 | Agilent Technologies | -- |
| Oroboros Oxygraph-2k呼吸测量仪 | Oroborus Instruments | -- | |
| ATP检测 | Enliten ATP检测系统 | Promega | -- |
| ROS检测 | 二氢乙锭 | -- | -- |
| H2S检测 | WSP-1荧光探针 | Cayman Chemicals | -- |
| 硝酸盐/亚硝酸盐检测 | 硝酸盐/亚硝酸盐荧光检测试剂盒 | Cayman Chemicals | -- |
| RNA-seq | Ribo-Zero试剂盒 | Illumina | -- |
| TruSeq文库构建试剂盒 | Illumina | -- | |
| RT-qPCR | iScript cDNA合成试剂盒 | Bio-Rad | -- |
| SsoAdvanced SYBR green预混液 | Bio-Rad | -- | |
| LC-MS/MS | Agilent 1200系列二元HPLC系统 | Agilent Technologies | -- |
| QTRAP 5500质谱仪 | AB/MDS Sciex | -- | |
| Waters Xterra C18色谱柱 | Waters | -- | |
| FNC分析 | [13C6]葡萄糖 | Sigma-Aldrich | -- |
| [13C2]乙酸 | Sigma-Aldrich | -- | |
| Micro BCATM蛋白检测试剂盒 | Thermo Scientific | -- | |
| •NO供体处理 | DETA/NO | Sigma | -- |
| 精胺NONOate | Cayman Chemicals | -- | |
| 氧化应激实验 | 甲萘醌 | -- | -- |
| 低氧实验 | 甲硝唑 | -- | -- |
| 巨噬细胞处理 | 氨基氧乙酸 | -- | -- |
| 细菌培养 | 泰洛沙泊 | Sigma-Aldrich | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠感染与生存分析 | 小鼠品系（C57BL/6J Cbs+/+与B6;129P2-Cbstm1Unc/J Cbs+/−）、感染途径（气管滴注或气溶胶）、初始感染剂量、每组10只、观察至300天 阅读提示：Methods中“Mtb infection of mice”与Fig. 1g图注 |
| GYY4137处理Mtb的体外生长与呼吸测量 | GYY4137浓度（5、10、25、50、100 µM）、spent GYY4137对照、处理时间（生长至12天，ATP 24小时，OCR实时）、NaHS验证 阅读提示：Methods中“H2S donor compounds and preparation”与“Bioenergetic analysis using the Seahorse XF96 analyzer”；Fig. 2图注 |
| cydC::aph突变株的呼吸与生长验证 | Mtb cydC::aph与互补株的构建、GYY4137浓度（10、25、50、100 µM）、OCR和CFU检测时间点 阅读提示：Methods中“Bacterial strains and growth conditions”；Fig. 4图注 |
| RNA-seq与qRT-PCR的H2S处理条件 | GYY4137 25 µM处理1小时、生物学重复数（RNA-seq每组3，qRT-PCR每组5）、低氧控制验证、差异表达阈值（倍数≥±1.5且q<0.05） 阅读提示：Methods中“Isolation of RNA and sequencing”与“Isolation of RNA and quantitative RT-PCR”；Fig. 5图注 |
| AOAA与GYY4137小鼠给药实验 | AOAA剂量13 mg/kg、每周6天、共6周；GYY4137剂量25 mg/kg、每周3天、共6周；腹腔注射；感染后2周开始治疗；每组5−6只 阅读提示：Methods中“AOAA/GYY4137 treatment in mice”；Fig. 6k、l图注 |