SST样本收集与病理分类
获取并确认SST肿瘤样本，用于遗传学分析。
从Fudan University Cancer Center和Massachusetts General Hospital获取FFPE SST组织，经四位病理学家中心审查确认26例为SST。
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卵巢硬化性间质瘤中复发性FHL2-GLI2致癌融合的鉴定
Identification of recurrent FHL2-GLI2 oncogenic fusion in sclerosing stromal tumors of the ovary.
实验完整度
高多组学分析（WES、RNA-seq、FISH）鉴定融合基因，体外功能实验验证致癌性及SHH通路机制。
主要模型
人卵巢硬化性间质瘤组织样本 永生化间充质干细胞（MSC） HEK-293细胞 DAOY髓母细胞瘤细胞
重点核对
FHL2-GLI2融合的断点涉及FHL2外显子1-5和GLI2外显子8-13（或外显子7-13） SHH通路激活通过PTCH1、GLI1/CCND1表达及GLI-RE荧光素酶报告基因检测 细胞增殖、迁移和集落形成能力评估 使用Vismodegib（250-500 nM）和GANT61（20 µM）抑制SHH通路
摘要
卵巢硬化性间质瘤（SST）是一种罕见的性索-间质肿瘤（SCST），其遗传基础目前尚不清楚。在此，利用全外显子组、靶向捕获和RNA测序，我们报道在65%（17/26）的SST中反复出现FHL2-GLI2融合基因，并在另外15%（4/26）的SST中发现其他GLI2重排，这些在其他类型的SCST（n=48）或常见癌症类型（n=9950）中均未检测到。FHL2-GLI2融合导致SST中Sonic Hedgehog（SHH）通路的转录组激活。在体外表达FHL2-GLI2融合导致获得SST的表型特征，增殖、迁移和集落形成增加，以及SHH通路激活。靶向抑制SHH通路可逆转这些致癌特性，表明其在SST发病机制中的作用。我们的结果表明FHL2-GLI2融合可能是SST的致癌驱动因素，定义了卵巢肿瘤中的基因型-表型关联。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 卵巢硬化性间质瘤（SST）的遗传基础是什么？是否存在特征性基因改变？
- 核心机制
- FHL2-GLI2融合基因导致GLI2 repression结构域缺失并保留DNA结合和激活结构域，通过FHL2启动子过表达截短的GLI2，从而激活SHH信号通路。
- 主要证据
- 在26例SST中65%检测到FHL2-GLI2融合，体外表达该融合基因导致SHH通路激活和致癌表型，SHH抑制剂可逆转这些表型。
- 研究意义
- FHL2-GLI2融合可能是SST的致病驱动因素和诊断标志物，SHH通路抑制可能为SST患者提供治疗途径。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
全外显子组和靶向测序鉴定突变
确定SST是否存在致病性体细胞突变或拷贝数改变。
对8例SST进行WES（n=3）或MSK-IMPACT（n=5）测序，分析突变负荷和拷贝数改变。
RNA测序鉴定融合基因
发现SST中的融合转录本。
对8例SST进行配对末端RNA测序，使用INTEGRATE、deFuse和FusionCatcher识别融合转录本，并用OncoFuse预测致癌潜力。
融合基因验证与频率检测
在扩大样本中验证FHL2-GLI2融合，并确定其在SST和其他肿瘤中的频率。
使用RT-PCR、FISH和RNA-ISH在26例SST和其他性索-间质肿瘤中检测融合基因，并查询TCGA数据库。
体外功能实验验证致癌性
验证FHL2-GLI2融合是否赋予细胞致癌特性。
在MSC、HEK-293、DAOY和BCC细胞中稳定表达FHL2-GLI2或tGLI2，检测增殖、集落形成和迁移能力。
SHH通路激活验证
确定FHL2-GLI2融合是否激活SHH通路，并探索机制。
通过RNA-seq差异表达分析、NanoString、RT-qPCR、Western blot和荧光素酶报告基因检测SHH通路基因表达，并通过ChIP和免疫共沉淀研究机制。
SHH抑制剂逆转致癌表型
验证抑制SHH通路能否逆转FHL2-GLI2诱导的致癌特性。
用Vismodegib（250-500 nM）和cyclopamine处理表达FHL2-GLI2的细胞，检测增殖、集落形成和迁移。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
验证机制链路
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| RNA-ISH | RNAscope探针BA-Hs-GLI2-3EJ | Advanced Cell Diagnostics | 801211 |
| RNAscope探针BA-Hs-FHL2-GLI2-FJ | Advanced Cell Diagnostics | 801221 | |
| RNAscope探针BA-Hs-FHL2-GLI2-FJ-O1 | Advanced Cell Diagnostics | 801231 | |
| 免疫组化 | ChromoPlex 1双重检测试剂盒 | Leica | DS9477 |
| 抗GLI2抗体（克隆OTl1G1） | Origene | TA804601 | |
| 抗Ki67抗体（MIB-1） | Dako | -- | |
| 细胞培养 | 间充质干细胞生长培养基 | Lonza | -- |
| 高糖DMEM培养基 | -- | -- | |
| Eagle最低必需培养基 | -- | -- | |
| 人基底细胞癌细胞系完全培养基 | CELPROGEN | -- | |
| 稳定细胞系构建 | pCDH-CMV-MCS-EF1α-GFP-T2A-Puro cDNA双启动子克隆和表达慢病毒载体 | System Biosciences | CD513B-1 |
| 野生型FHL2 ORF cDNA克隆 | GeneCopoeia | EX-M0686-Lv102 | |
| 野生型GLI2 ORF cDNA克隆 | GeneCopoeia | EX-Y4001-Lv102 | |
| FHL2-GLI2 ORF cDNA克隆 | GeneCopoeia | CS-Y4001-Lv102-01 | |
| 细胞培养 | 嘌呤霉素 | ThermoFisher Scientific | -- |
| 荧光素酶实验 | Gli-Luc报告基因pGL4[luc2P/Gli-RE/Hygro] | Promega | -- |
| Renilla-SV40 | Promega | -- | |
| 双荧光素酶试剂盒 | Promega | -- | |
| SUFU过表达质粒 | Origene | NM_016169 | |
| ChIP | ANTI-FLAG M2亲和凝胶 | Sigma | -- |
| QIAquick PCR纯化试剂盒 | Qiagen | -- | |
| PowerUp SYBR Green预混液 | Applied Biosystems | -- | |
| 免疫沉淀 | SUFU抗体（C81H7） | Cell Signaling Technology | 2522 |
| Protein G Dynabeads | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Western blot | 抗calretinin抗体 | Santa Cruz | SC-365956 |
| 抗PTCH1抗体 | Abcam | ab53715 | |
| 抗GLI1抗体 | Abcam | ab134906 | |
| 抗Cyclin D1抗体（92G2） | Cell Signaling | 2978 | |
| 抗FLAG M2抗体 | Sigma | F1804 | |
| 抗SUFU抗体 | Cell Signaling | 2522s | |
| 抗微管蛋白抗体（DM1A） | Cell Signaling | -- | |
| 抗兔二抗 | LI-COR | 926-68073 | |
| 抗鼠二抗 | LI-COR | 926-32212 | |
| 抑制剂处理 | 环巴胺 | Selleckchem | S1146 |
| 维莫德吉 | Cellagen tech | C4044-5 | |
| GANT61 | Tocris | 3191 | |
| RT-PCR | SuperScript VILO预混液 | Life Technologies; Thermo Fisher Scientific | -- |
| ExoSAP-IT | Affymetrix | -- | |
| RT-qPCR | RNeasy Mini试剂盒 | Qiagen | -- |
| RNeasy FFPE试剂盒 | Qiagen | -- | |
| StepOnePlus实时PCR系统 | Applied Biosystems; ThermoFisher | -- | |
| 细胞活力检测 | Cell Titer-Blue细胞活力检测 | Promega | -- |
| Victor X4多模式读板仪 | PerkinElmer | -- | |
| 划痕实验 | EVOS XL Core显微镜 | ThermoFisher Scientific | -- |
| 免疫荧光 | Alexa 647标记的山羊抗鼠二抗 | Life Technologies | A21236 |
| 含DAPI的Gold Prolong抗淬灭封片剂 | ThermoFisher Scientific | P36930 | |
| TCS SP5正置共聚焦显微镜 | Leica Microsystems | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 融合基因检测 | FISH阳性阈值：>15%细胞显示至少一个融合信号；RNA-ISH探针设计针对特定断点。 阅读提示：Methods: FHL2-GLI2 fluorescence in situ hybridization; Single-molecule RNA in situ hybridization; Supplementary Table 3, 4 |
| 体外功能实验 | 细胞系来源（MSC, HEK-293, DAOY, BCC）及培养基；稳定转染后嘌呤霉素筛选浓度（2 µg/ml，14天）；实验重复次数（至少三次独立实验）。 阅读提示：Methods: Cell lines; Generation of stable cell lines; 各功能实验小节 |
| SHH通路抑制实验 | 抑制剂浓度：Vismodegib 250 nM（增殖和迁移）或500 nM（集落形成）；GANT61 20 µM；溶剂对照DMSO。 阅读提示：Methods: Inhibitors; Figure legends 5d, 6a-c; Supplementary Fig. 9 |
| 荧光素酶报告基因实验 | 转染质粒量：Gli-Luc 90 ng，Renilla-SV40 10 ng；细胞接种密度25,000 cells/well；转染试剂lipofectamine 3000。 阅读提示：Methods: Luciferase assays; Figure 5b |
| ChIP实验 | 细胞用量：每ChIP 1000万细胞；交联剂1%甲醛；DNA剪切至200-500 bp；抗体用量50 µl ANTI-FLAG M2 Affinity Gel。 阅读提示：Methods: Crosslinked chromatin immunoprecipitation (ChIP); Figure 5e |