构建中间体相互作用组
鉴定中间体蛋白质相互作用网络
对10个中间体关键组分进行亲和纯化-质谱（AP-MS），在HeLa细胞中表达GFP/Flag/AcGFP标签的诱饵蛋白，同步化至末期，纯化中间体并进行质谱鉴定。
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中间体相互作用组揭示PP1磷酸酶在胞质分裂中的意外作用
The midbody interactome reveals unexpected roles for PP1 phosphatases in cytokinesis.
实验完整度
高包含体外细胞模型、酵母表达、体外磷酸酶实验及多种功能验证
主要模型
HeLa细胞 hTERT RPE-1细胞 HeLa S3细胞 酿酒酵母表达系统
重点核对
siRNA敲低PP1β、MYPT1后多核细胞比例分别增加4.2倍和7.2倍 MYPT1敲低导致MKLP1 S708磷酸化显著增加 PP1β在体外去磷酸化MKLP1 S708，VQF基序突变降低结合与去磷酸化效率 MKLP1AQA突变体 rescue 内源MKLP1敲低的效果显著低于野生型 GFP-MKLP1 pull-down显示MYPT1敲低减少MKLP1与PP1β及PRC1的相互作用
摘要
中间体是有丝分裂末期两个子细胞间细胞间桥上的细胞器，控制子细胞的最终分离，并参与细胞命运、极性、组织构建以及纤毛和管腔形成。本文报道了中间体蛋白质-蛋白质相互作用网络（相互作用组）的特征，该网络识别出许多先前未知的相互作用，为解析中间体的多种功能提供了极有价值的资源。对该相互作用组的初步分析揭示，PP1β-MYPT1磷酸酶调控胞质分裂后期的微管动力学，并使中心纺锤体复合物中的驱动蛋白组分MKLP1/KIF23去磷酸化。这种去磷酸化拮抗Aurora B激酶，从而改变中心纺锤体复合物在胞质分裂后期的功能与相互作用。我们的发现扩展了PP1在有丝分裂中的功能范畴，并表明激酶和对抗性磷酸酶分布的时空间变化精细调控胞质分裂蛋白的活性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 中间体蛋白质相互作用网络包含哪些相互作用，其中PP1磷酸酶在胞质分裂后期发挥什么作用？
- 核心机制
- PP1β-MYPT1磷酸酶通过其调节亚基MYPT1与PP1β结合，使MKLP1 S708去磷酸化，拮抗Aurora B激酶对MKLP1的磷酸化，从而调控中心纺锤体微管动力学和中间体结构。
- 主要证据
- 利用10个诱饵蛋白的AP-MS构建中间体相互作用组；siRNA敲低PP1β/MYPT1导致胞质分裂失败、中心纺锤体异常和MKLP1 S708磷酸化升高；体外磷酸酶实验证明PP1β直接去磷酸化MKLP1 S708；MKLP1AQA突变体不能有效 rescue 敲低表型。
- 研究意义
- 扩展了PP1在有丝分裂中的功能范畴，表明激酶和对抗性磷酸酶的时空间分布变化精细调控胞质分裂蛋白活性，为理解中间体多功能性提供资源。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证CIT-K相互作用及功能
确定CIT-K在胞质分裂中的相互作用变化及招募作用
利用稳定表达CIT-K::AcGFP的HeLa细胞进行AP-MS，比较不同细胞周期阶段的相互作用组；用SILAC定量MS比较CIT-K敲低后中间体蛋白质组变化。
筛选PP1磷酸酶功能
确定PP1家族磷酸酶在胞质分裂中的作用
对PP1α、PP1β、PP1γ和MYPT1进行siRNA敲低，检测多核细胞比例、中间体定位和蛋白质磷酸化水平。
分析MYPT1-PP1β在胞质分裂后期的功能
研究MYPT1-PP1β对中心纺锤体和中间体结构的调控
MYPT1敲低后，通过免疫荧光、活细胞延时成像和电子显微镜分析中心纺锤体稳定性、中间体组装和胞质分裂完成情况。
验证MKLP1为PP1β底物
确定PP1β是否直接去磷酸化MKLP1 S708
体外磷酸酶实验：Aurora B磷酸化GST-MKLP1(620-858)后，与MBP-PP1β或催化失活突变体孵育，检测S708磷酸化；酵母双杂交和pull-down验证相互作用；构建MKLP1AQA突变体进行rescue实验。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 分子克隆 | Gateway技术 | ThermoFisher | -- |
| QuikChange Lightning定点突变试剂盒 | Agilent | -- | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Sigma | -- |
| 胎牛血清 | Sigma | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Invitrogen | -- | |
| RNA干扰 | Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Invitrogen | -- |
| 细胞转染 | Neon转染系统 | ThermoFisher | -- |
| FuGENE转染试剂 | -- | -- | |
| 细胞同步化 | 胸苷 | Sigma-Aldrich | -- |
| 诺考达唑 | Sigma-Aldrich | -- | |
| MG132 | Sigma | -- | |
| 中间体纯化 | 紫杉醇 | Sigma-Aldrich | -- |
| Roche Complete蛋白酶抑制剂 | Roche | -- | |
| 亲和纯化 | GFP-Trap_MA磁珠 | ChromoTek | -- |
| 质谱分析 | NuPAGE LDS 4×上样缓冲液 | Invitrogen | -- |
| NuPAGE Novex 4–12% Bis-Tris蛋白质凝胶 | Invitrogen | -- | |
| 考马斯亮蓝G-胶体浓缩液 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 测序级胰蛋白酶 | Roche | -- | |
| LTQ Orbitrap Velos质谱仪 | Thermo Scientific | -- | |
| Ultimate 3000快速分离液相纳米超高压HPLC系统 | Dionex | -- | |
| PepMap C18预柱 | Dionex | -- | |
| PepMap分析柱 | Dionex | -- | |
| 荧光显微镜 | 含DAPI的VECTASHIELD封片剂 | Vector Laboratories | -- |
| Zeiss Axiovert落射荧光显微镜 | Zeiss | -- | |
| Western blot | 小鼠单克隆抗α-微管蛋白抗体（克隆DM1A） | Sigma | T9026 |
| 兔多克隆抗β-微管蛋白抗体 | Abcam | ab6046 | |
| 小鼠单克隆抗cyclin B1抗体（克隆GNS1） | Santa Cruz | sc-245 | |
| 小鼠单克隆抗PP1α抗体（克隆G-4） | Santa Cruz | sc-271762 | |
| 小鼠单克隆抗PP1β抗体（克隆A-6） | Santa Cruz | sc-365678 | |
| 小鼠单克隆抗PP1γ抗体（克隆A-4） | Santa Cruz | sc-515943 | |
| 小鼠单克隆抗CIT-K抗体 | BD Transduction Laboratories | 611377 | |
| 小鼠单克隆抗MYPT1抗体（克隆C-6） | Santa Cruz | sc-514261 | |
| 兔多克隆抗Aurora A抗体 | Abcam | ab1287 | |
| 兔多克隆抗TPX2抗体 | Novus Biologicals | NB500-179 | |
| 兔多克隆抗KIF14抗体 | Bethyl Laboratories | A300-233A | |
| 兔多克隆抗MKLP1抗体（克隆N19） | Santa Cruz Biotechnology | sc-867 | |
| 兔多克隆抗磷酸化MKLP1 pS708抗体 | -- | -- | |
| 兔多克隆抗三磷酸化CHMP4C pS210 pS214 pS215抗体 | -- | -- | |
| 小鼠单克隆抗Aurora B抗体（克隆AIM-1） | BD Transduction Laboratories | 611082 | |
| 小鼠单克隆抗PRC1抗体（克隆C-1） | Santa Cruz | sc-376983 | |
| 兔单克隆抗磷酸化PRC1 pT481抗体 | Abcam | ab62366 | |
| 兔多克隆抗磷酸化组蛋白H3 pS10抗体 | Merck | 06-570 | |
| 兔多克隆抗单磷酸化MRLC pS19抗体 | Cell Signaling Technology | 3671 | |
| 兔多克隆抗双磷酸化MRLC pT18 pS19抗体 | Cell Signaling Technology | 3674 | |
| 山羊多克隆抗RacGAP1抗体 | Abcam | ab2270 | |
| 小鼠单克隆抗GST抗体 | Abcam | ab92 | |
| 小鼠单克隆抗MBP抗体 | NEB | E8032 | |
| 蛋白质纯化 | 淀粉糖树脂 | New England Biolabs | -- |
| 谷胱甘肽Sepharose 4B | GE Healthcare | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 中间体相互作用组构建 | 诱饵蛋白标签类型、细胞系、同步化阶段、AP-MS重复次数 阅读提示：Methods中Affinity purification (AP)小节及Table 1 |
| PP1磷酸酶敲低 | siRNA序列、转染试剂、敲低时间（48小时）、多核细胞计数标准 阅读提示：Methods中Cell culture and treatments小节及Fig. 4h图注 |
| MKLP1去磷酸化验证 | MKLP1AQA突变位点（VQF786-788）、体外磷酸酶反应时间（10-60分钟）、酶量（200 ng） 阅读提示：Methods中In vitro GST pull-down and phosphatase assays小节及Fig. 7f图注 |
| 活细胞延时成像 | 细胞系（HeLa Kyoto表达GFP::tubulin和H2B::mCherry）、拍摄间隔（2分钟）、z轴切片数（14）、细胞计数 阅读提示：Methods中Time-lapse imaging小节及Fig. 6b,c图注 |