筛选对mTORC2活性降低的雷帕霉素类似物
从雷帕霉素类似物库中鉴定对mTORC2抑制活性降低但保持mTORC1抑制活性的化合物
在PC3细胞中筛选约90种雷帕霉素类似物，通过Western blot检测mTORC1读值p-S6 S240/S244和mTORC2读值p-AKT S473
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一种新型雷帕霉素类似物在体内对mTORC1具有高度选择性
A novel rapamycin analog is highly selective for mTORC1 in vivo.
实验完整度
高包含PC3细胞、MEFs体外模型和C57BL/6J小鼠体内模型，并进行功能与机制验证
主要模型
PC3细胞系 Tsc1−/−小鼠胚胎成纤维细胞 雌性C57BL/6J小鼠 雄性C57BL/6J小鼠
重点核对
DL001剂量：13 mg kg−1或12 mg kg−1，每隔一天腹腔注射，持续20天或5周 雷帕霉素剂量：8 mg kg−1，每隔一天腹腔注射 DL001处理浓度：0.3–100 nM（细胞实验）或100 nM（蛋白质组学和qPCR） Western blot检测mTORC1读值p-S6 S240/S244和mTORC2读值p-AKT S473 每组小鼠样本量：n=3–18只生物学独立动物
摘要
雷帕霉素是机制性雷帕霉素靶蛋白复合物1（mTORC1）的抑制剂，可延长寿命并显示出治疗年龄相关疾病的强大潜力。然而，雷帕霉素通过脱靶抑制第二个含mTOR的复合物mTORC2而产生代谢和免疫副作用。在此，我们报道了DL001的鉴定，这是一种FKBP12依赖性雷帕霉素类似物，对mTORC1的选择性比雷帕霉素高40倍。DL001在细胞培养系和C57BL/6J小鼠体内抑制mTORC1，在体内DL001抑制mTORC1信号而不损害葡萄糖稳态，并且对脂质代谢和免疫系统的副作用显著减少或没有。在细胞中，DL001有效抑制升高的mTORC1活性，并使缺乏功能性结节性硬化复合物的细胞恢复正常基因表达。我们的结果表明，在体内可以实现对mTORC1的高度选择性药理学抑制，并且选择性抑制mTORC1显著减少了与传统雷帕霉素类似物相关的副作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否开发出在体内高度选择性抑制mTORC1的雷帕霉素类似物，从而避免雷帕霉素对mTORC2的脱靶抑制及其相关副作用？
- 核心机制
- DL001是一种FKBP12依赖性雷帕霉素类似物，对mTORC1的选择性比雷帕霉素高44倍，在体内外选择性抑制mTORC1而不抑制mTORC2。
- 主要证据
- 在PC3细胞中，DL001抑制mTORC1的IC50为74.9 pM，抑制mTORC2的IC50为26,245.4 pM；在C57BL/6J小鼠中，DL001抑制多个组织的mTORC1信号，但不破坏mTORC2完整性，且不引起葡萄糖不耐受、血脂异常或显著免疫抑制。
- 研究意义
- 研究表明高度选择性药理学抑制mTORC1可在体内实现，并且可避免长期雷帕霉素治疗相关的许多副作用。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
比较DL001与雷帕霉素对mTORC1和mTORC2的抑制效力
确定DL001对mTORC1和mTORC2的IC50及选择性
用0.3–100 nM雷帕霉素或DL001处理PC3细胞48小时，Western blot检测p-S6K1 T389、p-S6 S240/S244和p-AKT S473；用AlphaLISA assay测定IC50
验证DL001对FKBP12的依赖性
检验DL001抑制mTORC1和mTORC2是否依赖FKBP12
在表达shCtrl、shFKBP12或shFKBP51的PC3细胞中，用0.3–100 nM DL001或雷帕霉素处理48小时，Western blot检测p-S6和p-AKT S473
评估DL001在体内对mTORC1和mTORC2的选择性
验证DL001在C57BL/6J小鼠体内选择性抑制mTORC1而不破坏mTORC2
给雌性C57BL/6J小鼠每隔一天腹腔注射13 mg kg−1 DL001或8 mg kg−1雷帕霉素，持续20天，检测11种组织中mTORC1和mTORC2信号；另用12 mg kg−1 DL001处理5周，检测肝脏mTORC1信号和mTORC2完整性
评估DL001对代谢和免疫系统的副作用
比较DL001与雷帕霉素对葡萄糖代谢、脂质代谢和免疫细胞的影响
雄性C57BL/6J小鼠每隔一天腹腔注射8 mg kg−1雷帕霉素或12 mg kg−1 DL001，持续5周，进行葡萄糖耐量试验、丙酮酸耐量试验、空腹血糖、血浆脂质测定和脾细胞流式分析
验证DL001对TSC1缺失细胞的mTORC1抑制效果
检验DL001能否抑制Tsc1−/− MEFs中升高的mTORC1活性并恢复基因表达
用100 nM雷帕霉素或DL001处理Tsc1+/+和Tsc1−/− MEFs 24小时，Western blot检测p-S6 S240/S244和p-AKT S473，qPCR检测糖酵解、甾醇合成和脂肪酸合成相关基因表达
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| Western blot | 抗磷酸化AKT S473抗体 | Cell Signaling Technology | 4060 |
| 抗AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 4691 | |
| 抗磷酸化p70 S6激酶抗体 | Cell Signaling Technology | 9234 | |
| 抗p70 S6激酶抗体 | Cell Signaling Technology | 2708 | |
| 抗磷酸化S6核糖体蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 2215或5364 | |
| 抗S6核糖体蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 2217 | |
| 抗磷酸化4EBP1 S65抗体 | Cell Signaling Technology | 9451 | |
| 抗磷酸化4EBP1 T37/S46抗体 | Cell Signaling Technology | 2855 | |
| 抗总4EBP1抗体 | Cell Signaling Technology | 9452 | |
| 抗磷酸化ULK1 S757抗体 | Cell Signaling Technology | 14202 | |
| 抗ULK1抗体 | Cell Signaling Technology | 8054 | |
| 抗mTOR抗体 | Cell Signaling Technology | 2792 | |
| 抗RICTOR抗体 | Cell Signaling Technology | 2140 | |
| 抗HSP90抗体 | Cell Signaling Technology | 4877 | |
| 抗β-微管蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 2128S | |
| 抗FKBP51抗体 | Cell Signaling Technology | 12210S | |
| 抗磷酸化PKA底物抗体 | Cell Signaling Technology | 9621 | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Sigma | A2228 | |
| 抗ATGL抗体 | Santa Cruz | SC-365278 | |
| 抗FKBP12抗体 | Abcam | ab2918 | |
| 免疫沉淀 | 抗RICTOR抗体 | Bethyl Laboratories | A300-458A |
| 蛋白G琼脂糖 | Fisher | PI20398 | |
| 流式细胞术 | 抗CD4抗体 | Tonbo | 75-0041-U025 |
| 抗CD8抗体 | Tonbo | 80-0081-U025 | |
| 抗CD25抗体 | eBioscience | 47-0251-80 | |
| 抗FOXP3抗体 | eBioscience | 25-5773-82 | |
| 抗CD11a抗体 | BD | 553121 | |
| 抗CD3抗体 | BD | 563204 | |
| 细胞培养 | F12K培养基 | ATCC/GIBCO | ATCC 30-2004 |
| 胎牛血清 | Gemini | 100–106 | |
| 青霉素/链霉素 | Life Technologies | 15140–122 | |
| L-谷氨酰胺 | Life Technologies | 25030 | |
| DMEM培养基 | Fisher Scientific | MT10013CV | |
| 胎牛血清 | Sigma | 12303C | |
| 青霉素-链霉素 | Fisher Scientific | MT30002CI | |
| DMEM/F-12培养基 | Fisher Scientific | MT10090CV | |
| 蛋白质组学 | TMT-10plex标记试剂 | ThermoFisher Scientific | -- |
| AlphaLISA | AlphaLISA SureFire磷酸化S6核糖体蛋白(Ser240/244)检测试剂盒 | Perkin Elmer | TGRS6P2S500 |
| AlphaLISA SureFire AKT 1/2/3 (S473)检测试剂盒 | Perkin Elmer | TGRA4S500 | |
| 葡萄糖测量 | Bayer Contour血糖仪和试纸条 | Bayer | -- |
| 胰岛素ELISA | 小鼠胰岛素ELISA试剂盒 | Crystal Chem | -- |
| 药物处理 | 雷帕霉素 | LC Labs | -- |
| 组织匀浆 | 2.0 mL Tough Tubes with Caps | Mo-Bio Laboratories | 13119–500 |
| 1.4 mM陶瓷珠 | Mo-Bio Laboratories | 13113-325 | |
| Western blot | 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物片剂 | Fisher | PI88669 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与处理 | PC3细胞培养基为F12K加10% FBS、1%青霉素/链霉素和2 mM L-谷氨酰胺；DL001处理浓度0.3–100 nM，时间48小时 阅读提示：Methods中Cell culture and shRNA knockdown及AlphaLISA assay小节 |
| 小鼠体内给药 | 雌性C57BL/6J小鼠13 mg kg−1 DL001或8 mg kg−1雷帕霉素，每隔一天腹腔注射，持续20天；雄性C57BL/6J小鼠12 mg kg−1 DL001或8 mg kg−1雷帕霉素，每隔一天，持续5周 阅读提示：Methods中Animals and treatments小节及图3、图4图注 |
| 葡萄糖和丙酮酸耐量试验 | 小鼠禁食16小时后注射1 g kg−1葡萄糖或2 g kg−1丙酮酸；GTT在治疗2周后进行，PTT在3周后进行 阅读提示：Methods中Tolerance tests and blood collection小节及图4a、b图注 |
| 流式细胞术 | 脾细胞制备后使用CD4、CD8、CD25、FOXP3、CD11a、CD3抗体染色，在BD LSRII上分析；每组n=9–18只小鼠 阅读提示：Methods中Splenocyte preparation and flow cytometry小节及图4g–i图注 |
| TSC1−/− MEFs实验 | Tsc1−/−和Tsc1+/+ MEFs用100 nM雷帕霉素或DL001处理24小时；qPCR检测Pdk1、Pfkp、Mvk、Sc5d、Ascl3、Scd1 阅读提示：Methods中Mouse embryonic fibroblast cell culture and qPCR小节及图5图注 |