体外抗白血病活性筛选
鉴定能够抑制RAC激活并具有抗白血病活性的化合物。
对化合物库进行虚拟筛选，选择多个化合物进行细胞活力、毒性、RAC活性检测。发现DW0069及其衍生物DW0254、DW0441具有活性。
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一种具有良好抗白血病效果的新型PDE6D-RAS相互作用小分子抑制剂的验证
Validation of a small molecule inhibitor of PDE6D-RAS interaction with favorable anti-leukemic effects
实验完整度
高包含体外细胞实验、化学蛋白质组学、饱和突变、晶体结构、体内异种移植模型等至少两项独立证据层级，并进行功能与机制验证。
主要模型
急性淋巴细胞白血病细胞系P12-ICHIKAWA CCRF-CEM细胞系 RS4;11细胞系 PANC-1细胞系 NBSGW小鼠异种移植模型 人CD34+造血祖细胞
重点核对
DW0254处理浓度：体外实验中主要使用1-100µM范围；体内实验中通过Alzet泵以500mg/ml浓度给药，维持血浆浓度>2µM PDE6D sgRNA文库筛选：使用ipUSEPR慢病毒载体转导P12-ICHIKAWA细胞，筛选条件为2µM DW0254处理14天 RAS定位实验：使用PANC-1细胞转染pEGFP-C3 KRAS4B G12V或NRAS G12D，处理浓度为20µM DW0254 体内实验：NSG或NBSGW小鼠（6-8周龄），皮下注射5×10^5 luciferase标记的P12-ICHIKAWA细胞，在第7天和第14天植入Alzet泵，治疗持续2周
摘要
在高风险白血病中普遍存在的RAS突变与复发和化疗耐药相关。直接靶向RAS蛋白的努力在很大程度上未获成功。然而，由于RAS介导的转化依赖于RAS相关的C3肉毒杆菌毒素底物（RAC）小GTPase的信号传导，我们假设靶向RAC可能是RAS突变肿瘤的有效治疗方法。在此，我们描述了多种能够抑制急性淋巴细胞白血病细胞系中RAC活化的小分子。其中之一，DW0254，在RAS突变的细胞中也显示出有前景的抗白血病活性。通过化学蛋白质组学和生物物理方法，我们确定了磷酸二酯酶6亚基δ（PDE6D），一种已知的RAS伴侣蛋白，的疏水口袋是该化合物的靶点。DW0254处理后RAS向质膜定位的抑制与通过磷脂酰肌醇-3-激酶/AKT依赖性机制抑制RAC相关联。我们的发现为PDE6D介导的转运对RAS依赖性RAC激活和白血病细胞存活的重要性提供了新的见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 探索一种通过抑制PDE6D-RAS相互作用来间接靶向RAS信号的新型治疗策略，以改善RAS突变型急性白血病的治疗效果。
- 核心机制
- DW0254结合PDE6D疏水口袋，干扰PDE6D与RAS的相互作用，导致RAS从质膜脱落，抑制下游PI3K/AKT和MAPK/ERK通路，进而抑制RAC激活，最终抑制白血病细胞存活。
- 主要证据
- 通过亲和标记质谱鉴定PDE6D为靶点，饱和突变和晶体结构确认结合位点，细胞实验显示RAC抑制、增殖抑制和凋亡，体内异种移植实验显示肿瘤生长减缓。
- 研究意义
- 验证了PDE6D作为急性白血病新分子靶点的可行性，并提示通过靶向RAS/AKT通路依赖性而非单纯RAS突变状态来指导治疗的可能性。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
靶点鉴定
通过化学蛋白质组学和生物物理方法确定DW0254的直接作用靶点。
使用光亲和标记探针PAL与DW0254竞争标记P12-ICHIKAWA和CCRF-CEM细胞，结合质谱鉴定PDE6D和SEPT11。随后通过重组蛋白验证和LC-MS/MS定位结合残基。
靶点验证与耐药突变
通过饱和突变和结构生物学验证PDE6D是功能性靶点，并确定关键结合位点。
设计PDE6D sgRNA文库，在P12-ICHIKAWA细胞中筛选耐药突变，鉴定R48_V49缺失。通过ITC和共结晶分析结合亲和力和结合模式。
机制研究
探讨DW0254对RAS定位及下游信号通路的影响。
使用共免疫沉淀检测PDE6D与RAS/ARL2的相互作用，活细胞成像观察RAS定位，Western blot检测AKT/ERK磷酸化，RAC活性检测。
体内抗白血病活性评估
验证DW0254在体内的抗白血病效果。
使用Alzet渗透泵持续给药的P12-ICHIKAWA异种移植模型，通过生物发光成像监测肿瘤进展和外周血原始细胞计数。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 细胞增殖检测 | DAPI | Thermo Fisher | -- |
| 凋亡检测 | 死细胞凋亡试剂盒（Annexin V FITC和PI） | Thermo Fisher | -- |
| 细胞周期分析 | 核糖核酸酶A | Sigma-Aldrich | -- |
| 碘化丙啶 | BD Biosciences | -- | |
| 细胞增殖追踪 | CellTrace™ Far Red | Thermo Fisher | -- |
| Western blot | 抗RAC抗体 | BD Transduction Laboratories | 610651 |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | A5441 | |
| 免疫沉淀 | 抗FLAG M2亲和凝胶 | Sigma-Aldrich | A2220 |
| 抗FLAG抗体 | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| Western blot | 抗RAS抗体 | Millipore Sigma | 05-1072 |
| 抗ARL2抗体 | Abcam | ab183510 | |
| 抗RASG12D抗体 | Cell Signaling | 14429S | |
| 抗KRAS4B抗体 | Millipore Sigma | WH0003845M1 | |
| 抗KRAS4A抗体 | Millipore Sigma | ABC1442 | |
| 抗NRAS抗体 | Santa Cruz | sc-31 | |
| 抗HRAS抗体 | Proteintech | 18295-1-AP | |
| 抗GAPDH抗体 | BETHYL | A300-641A | |
| 抗AKT抗体 | Cell Signaling | 9272 | |
| 抗ERK抗体 | Cell Signaling | 9102S | |
| 抗磷酸化AKT (Ser473)抗体 | Cell Signaling | 9271S | |
| 抗磷酸化ERK抗体 | Cell Signaling | 4377S | |
| RAS活性测定 | 活性RAS拉下检测试剂盒 | Millipore Sigma | Cat#17218 |
| RAC活性测定 | PAK-1 PBD拉下实验试剂盒 | Millipore Sigma | Cat#14325 |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher | -- |
| 活细胞成像 | 35mm培养皿 | Ibidi | -- |
| 流式细胞术 | BD LSR II | BD Biosciences | -- |
| HTRF实验 | EnVision 2104多功能读板机 | Perkin Elmer | -- |
| 等温滴定量热 | iTC200微量热仪 | MicroCal Inc. | -- |
| 蛋白质纯化 | 镍亲和柱 | -- | -- |
| Resource Q柱 | GE Healthcare | -- | |
| Superdex 75 | GE Healthcare | -- | |
| ANTI-FLAG® M2亲和凝胶 | Sigma-Aldrich | -- | |
| lentiviral packaging | psPAX2 | Addgene | -- |
| pMD2.G | Addgene | -- | |
| 慢病毒转导 | 嘌呤霉素 | InvivoGen | -- |
| 杀稻瘟菌素 | InvivoGen | -- | |
| 测序 | NEBNext Ultra II Q5 | NEB | -- |
| NextSeq550 | Illumina | -- | |
| 体内实验 | Alzet渗透泵 2001 | Alzet | -- |
| 生物发光成像 | IVIS Living Image软件 | Xenogen | -- |
| 荧光素 | PerkinElmer | Part #122799 | |
| 药物处理 | DW0254 | -- | -- |
| Deltarasin | -- | -- | |
| LY294002 | -- | -- | |
| U0126 | -- | -- | |
| 细胞培养 | MethoCult H4435培养基 | StemCell Technologies | -- |
| 流式分析 | BD Phosflow™ PE小鼠抗ERK1/2 (pT202/pY204) | BD Biosciences | -- |
| BD Phosflow™ PE小鼠抗Akt (pS473) | BD Biosciences | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞活力测定 | 细胞密度、处理浓度、处理时间、细胞系选择 阅读提示：Methods: Cell viability assay |
| RAC活性检测 | 细胞系、DW0254浓度、处理时间、裂解液、PAK1-PBD beads 阅读提示：Methods: RAS and RAC activity assay |
| 靶点鉴定（PAL-MS） | 细胞系、PAL探针和DW0254浓度、UV照射条件、质谱数据处理标准 阅读提示：Methods: PAL probe synthesis, photoaffinity labelling and LC-MS/MS |
| PDE6D突变筛选 | 细胞系、sgRNA文库、慢病毒转导效率、DW0254浓度和处理时间、测序分析方法 阅读提示：Methods: High density sgRNA library of human PDE6D |
| 体内疗效实验 | 动物品系、细胞移植数量、给药泵型号和浓度、泵植入时间、生物发光成像时间点 阅读提示：Methods: Alzet osmotic pump implantation and bioluminescent imaging |