建立EMT细胞模型并检测m6A水平变化
验证癌细胞发生EMT时mRNA整体m6A水平是否改变。
用TGF-β处理HeLa、HepG2、Huh7和A549细胞，通过LC-MS/MS和dot-blot检测mRNA m6A/A比率；用Smad2/3抑制剂SB431542预处理后检测m6A变化。
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RNA m6A甲基化调控癌细胞上皮-间质转化及Snail翻译
RNA m6A methylation regulates the epithelial mesenchymal transition of cancer cells and translation of Snail.
实验完整度
高包含细胞模型、m6A测序、多聚核糖体分析、小鼠移植瘤与尾静脉转移模型及临床样本分析。
主要模型
HeLa和HepG2细胞TGF-β诱导EMT模型 Mettl3Mut/− HeLa细胞 Huh7细胞皮下移植瘤和尾静脉转移裸鼠模型 HeLa稳定细胞尾静脉转移裸鼠模型
重点核对
TGF-β处理浓度10 ng/ml、时间3天 Mettl3Mut/− HeLa细胞中m6A水平低于野生型 Snail CDS区m6A基序GGAC突变（GGAC变为GGCC） YTHDF1 RIP-qPCR检测其与SNAI1 mRNA CDS区结合 裸鼠尾静脉注射细胞数1×10^6/只，8周后分析肺转移
摘要
N6-甲基腺苷（m6A）修饰已被认为与多种癌症的进展有关。我们发现，在上皮-间质转化（EMT）这一癌细胞转移的重要步骤中，癌细胞mRNA的m6A修饰增加。敲除甲基转移酶样3（METTL3）会下调m6A，并在体外和体内损害癌细胞的迁移、侵袭和EMT。m6A测序和功能研究证实，EMT的关键转录因子Snail参与m6A调控的EMT。Snail CDS（而非3'UTR）中的m6A触发癌细胞中Snail mRNA的多聚核糖体介导的翻译。功能缺失和功能获得研究证实，YTHDF1介导m6A增加的Snail mRNA翻译。此外，METTL3和YTHDF1的上调是肝癌患者总生存率（OS）的不良预后因素。我们的研究强调了m6A在调控癌细胞EMT及该过程中Snail翻译的关键作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- m6A修饰是否调控癌细胞上皮-间质转化（EMT）及其关键转录因子Snail的表达。
- 核心机制
- METTL3介导SNAI1 CDS区m6A甲基化，YTHDF1识别该m6A并与eEF-2协同促进Snail mRNA的翻译延伸，从而调控EMT。
- 主要证据
- TGF-β诱导的癌细胞中m6A水平升高；METTL3缺失抑制迁移、侵袭和EMT；m6A-seq和RIP-qPCR证实Snail CDS区m6A；多聚核糖体分析和荧光素酶报告基因显示m6A促进Snail翻译；YTHDF1敲低或过表达影响Snail表达；小鼠体内实验显示METTL3缺失抑制转移且可被Snail过表达逆转。
- 研究意义
- 揭示m6A修饰调控EMT和Snail翻译的机制，为靶向m6A修饰及其相关靶点开发抗肿瘤转移策略提供可能性。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
构建METTL3缺失细胞并评估EMT表型
明确METTL3缺失对癌细胞迁移、侵袭和EMT标志物的影响。
使用CRISPR/Cas9构建Mettl3Mut/− HeLa细胞，或sh-Mettl3/si-Mettl3敲低Huh7和HepG2细胞；通过伤口愈合、Transwell侵袭、qRT-PCR和western blot检测EMT标志物（FN1、MMP2、CDH1）。
m6A-seq鉴定EMT过程中m6A修饰变化基因
寻找EMT过程中m6A修饰动态变化的基因及潜在靶点。
对TGF-β诱导EMT的HeLa细胞和对照细胞进行m6A-seq，分析m6A峰分布、基序和差异基因，并进行GO富集分析。
验证Snail mRNA的m6A修饰及功能
确认Snail是m6A调控EMT的关键靶基因。
通过m6A-RIP-qPCR检测SNAI1 mRNA的m6A富集；在METTL3缺失或ALKBH5过表达细胞中检测Snail蛋白；过表达Snail观察对EMT表型的逆转。
解析m6A调控Snail表达的分子机制
确定m6A调控Snail mRNA翻译的具体机制。
检测Snail前体和成熟mRNA表达、亚细胞定位、mRNA稳定性、蛋白稳定性；构建荧光素酶报告基因和CDS突变体；多聚核糖体分析；RIP-qPCR检测YTHDF1结合；免疫共沉淀检测YTHDF1与eEF-2结合。
体内验证m6A对肿瘤转移的影响
评估METTL3缺失对体内肿瘤生长和转移的影响及Snail的逆转作用。
将sh-control和sh-Mettl3 Huh7细胞皮下注射或尾静脉注射裸鼠；将HeLa WT、Mettl3Mut/−、HeLaSnail和Mettl3Mut/− HeLaSnail细胞尾静脉注射裸鼠；分析肺转移瘤数量。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基 | GIBCO | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Invitrogen | -- | |
| MycoAlert支原体检测试剂盒 | -- | -- | |
| 转化生长因子-β | -- | -- | |
| 脂质体2000 | -- | -- | |
| RNAiMAX转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| 遗传霉素G418 | -- | -- | |
| SB431542 | -- | -- | |
| Transwell侵袭实验 | CytoSelect™ 24孔细胞侵袭实验试剂盒 | -- | -- |
| 基质胶 | BD bioscience | -- | |
| RNA提取和qRT-PCR | Trizol试剂 | Invitrogen | -- |
| Western blot | MMP2抗体 | Bioworld | BS1236 |
| 纤连蛋白抗体 | Novus | NBP1-91258 | |
| E-钙黏蛋白抗体 | Bioworld | 3195S | |
| ALKBH5抗体 | Abcam | ab69325 | |
| Snail抗体 | Bioworld | BS1853 | |
| ZEB1抗体 | Millipore | ABD53 | |
| eEF-1抗体 | Proteintech | 11402–1-AP | |
| eEF-2抗体 | Proteintech | 20107–1-AP | |
| YTHDF1抗体 | Abcam | ab99080 | |
| GAPDH抗体 | BOSTER | BM3876 | |
| LC-MS/MS | 核酸酶P1 | Sigma | -- |
| 碱性磷酸酶 | Sigma | -- | |
| C18色谱柱 | Agilent | -- | |
| Agilent 6410 QQQ三重四极杆液相色谱质谱仪 | Agilent | -- | |
| dot-blot | GenElute mRNA小量制备试剂盒 | Sigma‐Aldrich | -- |
| RiboMinus转录组分离试剂盒 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| Amersham Hybond N+膜 | GE Healthcare | -- | |
| 抗m6A抗体 | SySy | -- | |
| 辣根过氧化物酶标记抗兔IgG | Cell Signaling Technology | -- | |
| m6A-seq | FastTrack MAGMaxi mRNA分离试剂盒 | Invitrogen | -- |
| NEBNext Ultra定向RNA文库构建试剂盒 | New England BioLabs | -- | |
| m6A-RIP-qPCR | m6A抗体 | Synaptic Systems | -- |
| Dynabeads®蛋白A磁珠 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| Qubit® RNA HS检测试剂盒 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| 蛋白稳定性 | MG132 | -- | -- |
| 荧光素酶报告基因实验 | 报告基因裂解缓冲液 | Promega | E3971 |
| Dual-Glo荧光素酶检测系统 | Promega | -- | |
| 动物实验 | 基质胶 | BD Biosciences | -- |
| 组织芯片分析 | 组织芯片 | Alenabio | CS03–01–008 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| EMT细胞模型建立 | TGF-β浓度10 ng/ml，处理时间3天 阅读提示：Methods中Cell culture, treatments, and transfection小节 |
| METTL3缺失细胞 | Mettl3Mut/− HeLa细胞构建方法（CRISPR/Cas9） 阅读提示：Methods中Cell culture小节 |
| m6A-seq | 生物学重复数（两个），FDR阈值（<0.05） 阅读提示：Methods中m6A sequencing小节 |
| 多聚核糖体分析 | 梯度分离条件（非翻译<40S，翻译起始40S-80S，多聚核糖体>80S） 阅读提示：Results中m6A triggers translation of Snail mRNA小节及Fig. 4h |
| 体内转移实验 | 尾静脉注射细胞数（1×10^6/只），每组n=10，8周后分析 阅读提示：Methods中Experimental animals and xenograft models小节 |