鉴定A549细胞中FOXP1为EMT关键诱导因子
验证FOXP1在A549细胞TGF-β诱导EMT中的作用
在A549细胞中通过shRNA敲低FOXP1，检测CDH1、CDH2表达及迁移侵袭能力；并过表达FOXP1检测形态、CDH1、VIM表达及迁移侵袭。
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竞争性内源RNA是EMT调控回路的内在组成部分并调节EMT
Competitive endogenous RNA is an intrinsic component of EMT regulatory circuits and modulates EMT.
实验完整度
高包含A549和MCF10A两种细胞模型、CRISPR-Cas9突变、DICER1敲除、rescue实验及数学建模等多层功能与机制验证
主要模型
A549细胞（人肺癌细胞系） MCF10A细胞（人乳腺上皮细胞系）
重点核对
TGF-β1处理浓度4 ng/ml，培养基隔天更换 A549和MCF10A细胞经TGF-β1处理不同时间点（24、48、72、96 h）诱导EMT siRNA转染终浓度100 nM CRISPR-Cas9敲除/突变miR-21或miR-200c结合位点及DICER1 Transwell小室迁移和侵袭实验，每组n=6
摘要
竞争性内源RNA（ceRNA）假说提出了一种调控生物学过程的内在机制。然而，ceRNAs的动态变化是否能够调节miRNA活性仍存在争议。在此，我们研究了TGF-β诱导的上皮-间质转化（EMT）过程中ceRNAs的动态变化。我们观察到，在A549细胞EMT过程中被高度诱导的转录本TGFBI作为miR-21的ceRNA来调节EMT。我们进一步鉴定出FN1是MCF10A细胞中经典SNAIL-ZEB-miR200回路里miR-200c的ceRNA。实验检测和计算模拟表明，动态诱导的ceRNAs直接与经典双负反馈环路耦联，并且对EMT的诱导至关重要。这些结果有助于确立ceRNA在癌症EMT中的相关性，并提示ceRNA是EMT调控回路的内在组成部分，可能代表一种在肿瘤发生过程中破坏EMT的潜在靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- ceRNAs的动态变化是否能够调节miRNA活性，并在TGF-β诱导的EMT调控回路中发挥作用。
- 核心机制
- TGFBI作为miR-21的ceRNA、FN1作为miR-200c的ceRNA，通过竞争结合miRNA直接与经典双负反馈环路耦联，调节miRNA对靶基因的抑制活性，从而影响EMT。
- 主要证据
- A549细胞中TGFBI敲低及3′UTR rescue实验、CRISPR-Cas9突变miR-21结合位点、DICER1敲除实验和绝对qPCR；MCF10A细胞中FN1敲低及3′UTR rescue、CRISPR-Cas9突变miR-200c结合位点、DICER1敲低实验；以及数学模拟再现EMT动力学。
- 研究意义
- 提示ceRNA是EMT调控回路的内在组成部分，可能代表在肿瘤发生过程中破坏EMT的潜在靶点，并可能成为干预转移的新参数。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证FOXP1与miR-21形成双负反馈环路
确定miR-21是否靶向FOXP1并与其形成双负反馈环路
通过miRNA-seq分析EMT中差异表达miRNA，结合targetScan预测和绝对拷贝数筛选miR-21；荧光素酶报告验证miR-21结合位点；antagomiR敲低miR-21检测EMT基因；CRISPR-Cas9突变FOXP1 3′UTR miR-21结合位点后重复实验；siRNA敲低FOXP1检测miR-21表达。
验证TGFBI作为miR-21的ceRNA调节EMT
确定TGFBI是否通过竞争结合miR-21发挥ceRNA功能
分析miR-21 MRE动态变化并进行绝对qPCR定量；计算模拟结合位点占据率；siRNA敲低TGFBI并检测FOXP1、CDH1、CDH2、miR-21及迁移侵袭；3′UTR rescue实验；DICER1敲除及CRISPR-Cas9突变TGFBI miR-21结合位点后重复实验；Kaplan-Meier生存分析。
验证FN1作为miR-200c的ceRNA调节EMT
确定FN1是否在MCF10A细胞中作为miR-200c的ceRNA调控经典ZEB-miR200回路
利用公共时间序列数据评估miR-200c MRE动态；绝对qPCR定量miR-200c和FN1；计算模拟结合位点占据率；siRNA敲低FN1在EMT 48 h转染并48 h后检测；3′UTR rescue；DICER1敲低及CRISPR-Cas9突变FN1 miR-200c结合位点后重复实验。
数学模拟EMT调控回路中FN1的ceRNA作用
验证包含FN1 ceRNA效应的数学模型能否再现EMT动力学
基于Zhang等CBS模型，修改miR-200c回收率并由ODE描述FN1动力学；进行分岔分析和300 h时间进程模拟，与经典模型比较。
验证ceRNA丰度决定EMT可逆性
检验ceRNA与miRNA化学计量比是否影响EMT向MET的可逆性
A549和MCF10A细胞经4 ng/ml TGF-β处理7天诱导EMT后撤除TGF-β 3天，观察自发MET；分别用TGFBI 3′UTR、antagomiR-21、siFN1、FN1 3′UTR或miR-200c处理，通过形态学和流式检测CDH1/VIM。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM/F-12培养基 | Corning | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 马血清 | Invitrogen | 16050-122 | |
| 青霉素/链霉素（100×溶液） | Invitrogen | 15070-063 | |
| EMT诱导 | 转化生长因子β1 | Gibco | PHG9214 |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | TaKaRa | -- |
| 逆转录 | PrimeScript逆转录试剂盒 | TaKaRa | -- |
| qRT-PCR | SYBR Premix Ex Taq（Tli RNase H Plus） | TaKaRa | -- |
| 绝对定量PCR | Hairpin-it miRNA qRT-PCR试剂盒 | Shanghai GenePharma Co., Ltd | E01006 |
| Hairpin-it miRNA qRT-PCR试剂盒 | Shanghai GenePharma Co., Ltd | E22001 | |
| siRNA转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| DharmaFECT Formulation 1转染试剂 | Dharmacon | -- | |
| siRNA与质粒共转染 | DharmaFECT Duo转染试剂 | Dharmacon | -- |
| CRISPR-Cas9 | lentiCas9-Blast载体 | Addgene | 52962 |
| lentiGuide-Puro载体 | Addgene | 52963 | |
| BsmBI限制酶 | Fermentas | -- | |
| 迁移侵袭实验 | Transwell小室（8 μm孔径） | Costar | -- |
| 免疫荧光 | E-cadherin抗体 | Invitrogen | A15757 |
| 波形蛋白抗体 | Abcam | ab92547 | |
| DAPI | Invitrogen | -- | |
| Western blot | 聚偏二氟乙烯膜 | Merck Millipore | -- |
| DICER1抗体 | CST | D38E7 | |
| TGFBI抗体 | Abcam | ab170874 | |
| FOXP1抗体 | CST | 4402 | |
| 纤连蛋白抗体 | Santa Cruz | sc-9068 | |
| E-cadherin抗体 | CST | 3195s | |
| N-cadherin抗体 | CST | 14215s | |
| 荧光素酶报告基因 | pMIR报告基因荧光素酶载体 | -- | -- |
| 荧光素酶检测系统 | Promega | E2510 | |
| 流式细胞术 | E-cadherin抗体 | Life Technologies | A15757 |
| 波形蛋白抗体 | Abcam | ab203428 | |
| 细胞培养 | 表皮生长因子 | -- | -- |
| 氢化可的松 | -- | -- | |
| 霍乱毒素 | -- | -- | |
| 胰岛素 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与EMT诱导 | TGF-β1处理终浓度4 ng/ml；培养基隔天更换；细胞接种于无血清培养基24 h至约70%融合后再处理；MCF10A完全培养基含5% Horse Serum、20 ng/ml EGF、0.5 mg/ml Hydrocortisone、100 ng/ml Cholera Toxin、10 μg/ml Insulin；FBS中含TGF-β1可能诱导部分EMT 阅读提示：Methods中Cell culture小节 |
| TGFBI与miR-21的ceRNA实验 | TGFBI siRNA在TGF-β处理前24 h转染，于EMT 24 h检测；siRNA终浓度100 nM；miR-21 antagomiR处理；CRISPR-Cas9突变FOXP1和TGFBI的miR-21结合位点；DICER1敲除 阅读提示：Methods中Transient siRNA knockdown and transfection of 3′UTR及Mutagenesis with CRISPR-Cas9小节，Fig. 2、Fig. 3及Supplementary Fig. 6 |
| FN1与miR-200c的ceRNA实验 | FN1 siRNA在EMT 48 h转染并48 h后检测；DICER1 siRNA敲低MCF10A；CRISPR-Cas9分别突变FN1保守和非保守miR-200c结合位点 阅读提示：Methods中Transient siRNA knockdown and transfection of 3′UTR及Mutagenesis with CRISPR-Cas9小节，Fig. 4及Supplementary Fig. 8–9 |
| 迁移侵袭实验 | Transwell孔径8 μm；每小室2×104细胞；下室含10% FBS作为趋化因子；24 h后计数；随机六个视野（×10）计数；每组n=6 阅读提示：Methods中Transwell migration and invasion assay小节及Fig. 1c–d、Fig. 3e |
| EMT可逆性实验 | 4 ng/ml TGF-β处理7天诱导EMT，撤除TGF-β后处理3天；TGFBI 3′UTR、antagomiR-21、siFN1、FN1 3′UTR或miR-200c处理；流式CDH1/VIM双染定量 阅读提示：Fig. 6和Fig. 7图注及Methods中Flow cytometry小节 |
| 绝对定量与数学建模 | 合成TGFBI和FN1 mRNA片段及合成miRNA生成标准曲线；MRE数目用targetScan或pictar保守位点预测；CBS模型回收率λ由0.5改为0.9，模拟FN1敲低时降解速率常数增至1；Oscill8进行分岔分析 阅读提示：Methods中Absolute quantification of mRNAs and miRNAs、Estimating number of MREs、Mathematical modeling of EMT-regulatory circuits小节及Supplementary Table 7 |