远侧附属物超微结构表征
确定远侧附属物在二维和三维电镜下的形态、尺寸及与微管三联体的关系。
对HeLa、RPE-1和mTEC细胞进行化学固定或高压冷冻后电镜连续切片（80 nm和120 nm），并进行电子断层扫描重建。
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通过关联STORM和电子显微镜高分辨率表征中心粒远侧附属物的形态和动力学
High-resolution characterization of centriole distal appendage morphology and dynamics by correlative STORM and electron microscopy.
实验完整度
高包含STORM/SIM/电镜/电子断层多层级成像，细胞模型验证及机制干预（Plk1/Aurora A抑制、基因敲除）。
主要模型
RPE-1细胞（Centrin1-GFP） HeLa细胞（Centrin1-GFP） mIMCD3细胞 小鼠气管上皮细胞（mTEC）
重点核对
RPE-1、HeLa、mIMCD3细胞中DAPs的3D STORM九重分布模式 关联STORM/EM确定CCDC41、FBF1、SCLT1、Cep164相对于EM密度的定位 Cep164截短体（Δ1200等）在Cep164敲低细胞中的STORM定位 Plk1抑制剂BI2536（200 nM）和Aurora A抑制剂MLN8237（250 nM）处理2-4小时对有丝分裂前DAP动态的影响 ANKRD26−/−细胞的CRISPR/Cas9敲除及Western blot验证
摘要
中心粒是形成中心体和纤毛的重要细胞结构。纤毛的形成和功能依赖于一组中心粒远侧附属物。在本研究中，我们使用关联超分辨率和电子显微镜来精确确定远侧附属物蛋白相对于中心粒微管和附属物电子密度的定位。在这里，我们表征了一种新的远侧附属物蛋白ANKRD26，并高分辨率地详细描述了远侧附属物组装的初始步骤。我们进一步表明，远侧附属物在有丝分裂前经历剧烈的超微结构重组，在此期间它们暂时失去外部组件，而内部组件保持九重组织。最后，使用电子断层扫描，我们揭示了哺乳动物远侧附属物通过一个精细的纤维状基部与两个中心粒微管三联体相关联，并且它们看起来几乎是径向的指状突起。我们的发现挑战了哺乳动物远侧附属物作为贯穿有丝分裂维持的风车状结构的传统描述。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 哺乳动物中心粒远侧附属物的蛋白质定位、组装过程及细胞周期中的动态变化如何？
- 核心机制
- 远侧附属物通过纤维状基部锚定于两个微管三联体，呈指状放射突起；其组装依赖内部组件CCDC41和SCLT1在G2期先积累，外部组件Cep164、FBF1和ANKRD26在分裂晚期和G1早期随后积累；有丝分裂前外部组件暂时丢失而内部组件保持九重组织，Plk1和Aurora A参与调控Cep164的动态。
- 主要证据
- 3D STORM和SIM揭示DAPs九重分布；关联STORM/EM定位CCDC41于头密度下方、FBF1与头密度共定位、SCLT1于头密度尖端、Cep164 N端环状围绕头密度；电子断层扫描显示纤维状基部和指状突起；细胞周期定量显示DAPs顺序积累和丢失；Plk1/Aurora A抑制实验。
- 研究意义
- 挑战了哺乳动物远侧附属物为风车状永久结构的传统观点，揭示其动态重塑特性，为理解纤毛形成、维持及附属物相关信号传导提供高分辨率结构基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
DAPs的3D STORM分布分析
揭示核心DAPs（CCDC41、SCLT1、FBF1、Cep164、ANKRD26）在中心粒周围的纳米级分布模式。
在RPE-1、HeLa和mIMCD3细胞中对DAPs进行免疫标记，使用3D STORM成像，分析九重对称性和环状直径。
关联STORM/EM定位DAPs
将STORM信号与电镜电子密度精确对齐，确定各DAP相对于EM密度的空间位置。
对免疫标记的RPE-1 C1-GFP细胞先进行STORM成像，后固定、包埋、连续切片，电镜成像，并进行图像对齐和叠加。
DAPs纵向分布测量
确定DAPs沿中心粒近端-远端轴的分布及相对位移。
对水平取向的中心粒进行3D STORM和双色SIM成像，测量信号长度和中心位移。
Cep164结构域定位分析
确定Cep164不同截短体在远侧附属物上的空间组织。
构建RFP-HA标记的全长和截短Cep164（ΔN99、ΔN297、ΔN1200），在Cep164敲低细胞中表达，用STORM检测HA信号位置。
远侧附属物组装时序分析
确定各DAPs在年轻母中心粒上首次出现的时间及组装顺序。
在RPE-1细胞周期各阶段定量DAPs与年轻母中心粒的关联水平，并用STORM观察组装中间态。
有丝分裂前远侧附属物重塑分析
验证成熟中心粒远侧附属物在有丝分裂前是否发生结构重组。
定量各DAPs与年老母中心粒的关联水平，STORM观察Cep164和FBF1信号变化，电镜定量DA密度。
Plk1和Aurora A调控实验
检验Plk1和Aurora A是否参与有丝分裂前DAPs的动态调控。
用BI2536抑制Plk1、MLN8237抑制Aurora A，处理HeLa和mIMCD3细胞2-4小时，免疫标记并定量DAPs和纤毛吸收。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞周期动态
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Invitrogen | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 25 mm圆形1.5高精度盖玻片 | Warner Instruments | -- | |
| 药物处理 | BI2536 | Selleckchem | -- |
| MLN8237 | Selleckchem | -- | |
| mTEC培养 | 链霉蛋白酶E | -- | -- |
| DNase I | -- | -- | |
| Transwell-Clear通透性滤膜支持物 | Corning | -- | |
| mTEC-Plus培养基 | -- | -- | |
| mTEC无血清培养基 | -- | -- | |
| 细胞培养 | Fungizone | Life Technologies | -- |
| CRISPR/Cas9敲除 | lentiGuide-puro载体 | Addgene | 52963 |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| 0.45微米注射器滤器 | Denville | -- | |
| 聚凝胺 | MilliporeSigma | -- | |
| 嘌呤霉素 | MilliporeSigma | -- | |
| 免疫荧光 | 甲醛 | -- | -- |
| 甲醇 | -- | -- | |
| 牛血清白蛋白 | -- | -- | |
| Tween-20 | -- | -- | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | 33342 | |
| Cep164兔抗体 | Proteintech | 22227-1-AP | |
| FBF1兔抗体 | Sigma | HPA036561 | |
| SCLT-1兔抗体 | Sigma | HPA036561 | |
| CCDC41/Cep83兔抗体 | Sigma | HPA038161 | |
| ODF-2兔抗体 | Proteintech | 12058-1-AP | |
| TTBK2抗体 | Sigma | HPA018113 | |
| ANKRD26抗体 | GeneTex | GTX128255 | |
| 乙酰化微管蛋白鼠抗体 | Sigma | T7451 | |
| CF647抗鼠二抗 | Biotium | 20042 | |
| CF647抗兔二抗 | Biotium | 20045 | |
| CF568抗兔二抗 | Biotium | 20099 | |
| CF568抗鼠二抗 | Biotium | 20109 | |
| AF488抗鼠二抗 | Invitrogen | A11019 | |
| AF488抗兔二抗 | Invitrogen | A11034 | |
| CF647抗体标记试剂盒 | Biotium | 92259 | |
| SIM成像 | TetraSpeck荧光微球 | Invitrogen | -- |
| STORM成像 | CF647标记的FAB2抗体 | Biotium | -- |
| Attofluor细胞腔室 | Thermofisher | -- | |
| β-巯基乙胺 | -- | -- | |
| 葡萄糖氧化酶 | -- | -- | |
| 过氧化氢酶 | -- | -- | |
| 葡萄糖 | -- | -- | |
| Tris | -- | -- | |
| N-STORM4.0系统 | Nikon | -- | |
| Apo TIRF 100X SA NA 1.49 Plan Apo油镜 | Nikon | -- | |
| 背照式EMCCD相机 | Andor | DU897 | |
| 宽场荧光显微镜 | Nikon Eclipse Ti倒置显微镜 | Nikon | -- |
| CoolSNAP HQ2相机 | Photometrics | -- | |
| Intensilight C-HGFIE照明器 | Nikon | -- | |
| SIM成像 | N-SIM | Nikon | -- |
| EMCCD相机 | Andor | DU897 | |
| 电镜 | 醋酸铀 | -- | -- |
| EMbed-812树脂 | -- | -- | |
| Leica EM ICE高压冷冻仪 | Leica | -- | |
| 牛血清白蛋白 | -- | -- | |
| Formvar包被铜网 | -- | -- | |
| 柠檬酸铅 | -- | -- | |
| Hitachi透射电子显微镜 | Hitachi | -- | |
| FEI Spirit透射电子显微镜 | FEI | -- | |
| 电子断层扫描 | 10纳米胶体金颗粒 | Sigma | -- |
| TemCam-F416相机 | TVIPS | -- | |
| Philips Tecnai F20电子显微镜 | Philips | -- | |
| JEM 1400电子显微镜 | JEOL | -- | |
| 质粒构建与转染 | pcDNA3.1(+)载体 | -- | -- |
| pEGFP-Cep164 | Addgene | 411496 | |
| GenJet DNA转染试剂 | Life Science's Service Center | M0014 | |
| Cep164 siRNA寡核苷酸 | Dharmacon | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞模型与培养 | RPE-1、HeLa、mIMCD3细胞来源和培养条件；RPE-1血清饥饿24小时诱导纤毛；mTEC分离和气液界面培养 阅读提示：Methods 'Cell cultures and drug treatment'和'mTEC cultures'小节 |
| 药物处理 | BI2536浓度200 nM、MLN8237浓度250 nM、处理时间2-4小时、溶剂对照 阅读提示：Methods 'Cell cultures and drug treatment'小节及Figure 7图注 |
| STORM成像 | 成像缓冲液配方（25 mM β-巯基乙胺、0.5 mg/mL葡萄糖氧化酶、67 μg/mL过氧化氢酶、10%葡萄糖、100 mM Tris pH 8.0）；647 nm激光功率；帧率50 Hz；采集时间点15000-30000 阅读提示：Methods 'Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM)'小节 |
| 关联STORM/EM | 中心粒垂直取向标准；收缩系数测定方法；对齐误差<5度；80 nm连续切片 阅读提示：Methods 'Correlative STORM and EM'和'Alignment of STORM and EM images'小节 |
| 电镜样品制备 | 化学固定（2.5%戊二醛+0.5%多聚甲醛）或高压冷冻条件；QFS溶液配方；切片厚度80或120 nm 阅读提示：Methods 'Electron microscopy'小节 |
| 定量分析 | 荧光强度测量面积恒定；背景扣除；每种条件至少20个中心体；统计检验方法（双尾Student t检验，P<0.001） 阅读提示：Methods 'Fluorescence intensity measurement'和'Statistics'小节 |