内皮特异性MST1敲除小鼠视网膜血管生成表型分析
探究MST1在出芽性血管生成中的作用
利用Mst1i∆EC小鼠从P1诱导敲除，P6分析视网膜血管分支、密度、增殖、凋亡、尖端细胞形态和极性标志物。
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MST1-FOXO1级联确立内皮尖端细胞极性并促进出芽性血管生成
A MST1-FOXO1 cascade establishes endothelial tip cell polarity and facilitates sprouting angiogenesis.
实验完整度
高包含内皮特异性基因敲除小鼠视网膜和脑模型、原代HUVEC体外实验及OIR病理模型，有多层次功能与机制验证
主要模型
Mst1内皮特异性敲除小鼠（Mst1i∆EC） Foxo1内皮特异性敲除小鼠（Foxo1i∆EC） 原代人脐静脉内皮细胞（HUVEC） 氧诱导视网膜病变（OIR）小鼠模型
重点核对
Mst1i∆EC和Foxo1i∆EC小鼠从P1起他莫昔芬诱导敲除，P6和P12分析视网膜血管 HUVEC在1% O2缺氧条件下处理不同时间（30分钟至36小时）检测pMST1和pFOXO1 HUVEC中Trolox（1 mM）和Rotenone（2.5 μM）处理以验证ROS和线粒体来源 HUVEC中VEGF（200 ng/ml）处理30分钟评估FOXO1核质穿梭 OIR模型：P7小鼠75%氧气5天再回到室内空气5天
摘要
缺氧是出芽性血管生成的主要驱动因素，但尖端内皮细胞如何被导向缺氧区域仍知之甚少。在本研究中，我们展示内皮MST1-FOXO1级联对于尖端细胞向缺氧区域的方向性迁移至关重要。在小鼠中，内皮特异性敲除MST1或FOXO1会导致尖端细胞极性丧失以及随后的出芽性血管生成受损。机制上，MST1被缺氧反应中线粒体产生的活性氧（ROS）激活，活化的MST1促进FOXO1的核输入，从而增强其对极性和迁移相关基因的转录调控。此外，内皮MST1-FOXO1级联在氧诱导视网膜病变模型中对于血管再通和新生血管形成是必需的。总之，我们的研究结果描绘了在出芽性血管生成过程中，细胞外缺氧与细胞内ROS-MST1-FOXO1级联之间在建立内皮尖端细胞极性方面的关键耦合。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 缺氧如何引导尖端内皮细胞向缺氧区域迁移，以及MST1-FOXO1级联在此过程中的作用。
- 核心机制
- 缺氧诱导线粒体产生ROS，激活MST1，MST1磷酸化FOXO1 Ser212促进其核输入，FOXO1转录调控极性和迁移相关基因，从而建立尖端细胞极性。
- 主要证据
- 内皮特异性敲除MST1或FOXO1小鼠显示尖端细胞极性丧失和血管生成受损；HUVEC中缺氧通过ROS激活MST1-FOXO1；MST1磷酸化FOXO1 Ser212介导核输入；OIR模型中MST1-FOXO1级联是血管再通和新生血管形成所必需。
- 研究意义
- 揭示了细胞外缺氧与细胞内ROS-MST1-FOXO1级联之间的关键耦合，在发育性和病理性血管生成中确立尖端细胞极性。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
MST1敲除小鼠三维血管分支和脑部血管生成分析
评估MST1在三维空间血管生成中的作用
分析P12视网膜深层血管丛和脑部血管生成，检测垂直生长、血管交叉、管腔形成、基底膜沉积和屏障完整性。
MST1与Hippo通路的关系验证
确定MST1是否通过经典Hippo通路调控血管生成
比较Mst2 null、Lats1/2i∆EC小鼠视网膜血管表型，检测TAZ表达。
FOXO1作为MST1下游的验证
探究MST1是否调控FOXO1亚细胞定位
免疫荧光检测Mst1i∆EC小鼠视网膜尖端细胞中FOXO1定位和Angpt2表达。
内皮特异性FOXO1敲除小鼠表型分析
确定FOXO1在尖端细胞极性中的作用
利用Foxo1i∆EC小鼠从P1诱导敲除，P6分析视网膜血管形态和尖端细胞极性。
缺氧激活MST1-FOXO1级联的体外验证
探究缺氧是否通过ROS激活MST1-FOXO1
HUVEC在1% O2下处理不同时间，检测pMST1、pFOXO1、HIF1α；使用Trolox和Rotenone抑制ROS和线粒体电子传递链。
MST1调控FOXO1核输入的机制验证
阐明MST1磷酸化FOXO1 Ser212促进核输入
HUVEC中转染siMST1，VEGF刺激下检测FOXO1核质分布；HEK293T细胞转染GFP-FOXO1-WT或S212A及FLAG-MST1，检测核输入。
MST1-FOXO1在细胞迁移和极性中的功能验证
评估MST1和FOXO1在定向迁移和极性建立中的作用
HUVEC中转染siMST1或siFOXO1，进行划痕实验，追踪细胞迁移，检测高尔基体、微管组织中心和板状伪足极性。
MST1-FOXO1调控的转录组分析
揭示MST1和FOXO1共同调控的基因网络
对siCont、siMST1、siFOXO1的HUVEC进行RNA测序，分析差异表达基因和GO富集；验证靶基因CCBE1和CXCL8。
MST1-FOXO1在病理性血管生成中的作用
验证MST1-FOXO1在OIR模型中的必要性
利用Mst1i∆EC和Foxo1i∆EC小鼠进行OIR模型，分析无血管面积、新生血管簇、FOXO1定位和Angpt2表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 诱导Cre活性 | 他莫昔芬 | Sigma-Aldrich | T5648 |
| 玉米油 | Sigma-Aldrich | C8267 | |
| 免疫荧光 | 仓鼠抗CD31单克隆抗体 | Millipore | MAB1398Z |
| Isolectin B4 (IB4)，Alexa Fluor 594标记 | Thermo Fisher Scientific | I21413 | |
| 大鼠抗VE-cadherin单克隆抗体 | BD Pharmingen | 555289 | |
| 小鼠抗VE-cadherin单克隆抗体 | BD Biosciences | #555661 | |
| 兔抗ERG单克隆抗体 | Abcam | ab92513 | |
| 兔抗cleaved-caspase-3多克隆抗体 | CST | #9664 | |
| 兔抗pHH3多克隆抗体 | Millipore | 05-806 | |
| 兔抗IV型胶原多克隆抗体 | Bio-Rad | 2150-1470 | |
| 大鼠抗ICAM2单克隆抗体 | BD Pharmingen | 553326 | |
| 大鼠抗TER119单克隆抗体 | BD Pharmingen | 561033 | |
| 兔抗GLUT1多克隆抗体 | EMD Millipore | 07-1401 | |
| 小鼠抗GM130单克隆抗体，Alexa Fluor 647标记 | BD Biosciences | #558712 | |
| 兔抗TAZ多克隆抗体 | Sigma-Aldrich | HPA007415 | |
| 兔抗FOXO1单克隆抗体 | CST | #2880 | |
| 人抗Angpt2单克隆抗体（克隆4H10） | -- | -- | |
| 鬼笔环肽，Alexa Fluor 488标记 | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| 鬼笔环肽，Alexa Fluor 594标记 | Thermo Fisher Scientific | A12381 | |
| 小鼠抗caveolin-1单克隆抗体 | Abcam | ab17052 | |
| 兔抗GM130多克隆抗体，Alexa Fluor 555标记 | Thermo Fisher Scientific | PA1-077-A555 | |
| 兔抗GM130多克隆抗体，Alexa Fluor 647标记 | Thermo Fisher Scientific | PA1-077-A647 | |
| 小鼠抗α-tubulin单克隆抗体，Alexa Fluor 488标记 | Thermo Fisher Scientific | #322588 | |
| 小鼠抗vinculin单克隆抗体，Alexa Fluor 488标记 | Thermo Fisher Scientific | #53-9777-80 | |
| 小鼠抗pericentrin单克隆抗体 | Abcam | ab28144 | |
| Vectashield封片剂 | Vector Laboratories | H-1200 | |
| EdU掺入实验 | 5-乙炔基-2′-脱氧尿苷 | Invitrogen | A10044 |
| EdU检测 | Click-iT EdU Alexa Fluor-555成像试剂盒 | Invitrogen | C10338 |
| 细胞培养 | 人脐静脉内皮细胞 | Lonza | C2519A |
| EGM2培养基 | Lonza | -- | |
| 明胶 | -- | -- | |
| 细胞处理 | 血管内皮生长因子 | R&D systems | 293-VE-010 |
| 鱼藤酮 | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Trolox | Millipore | 648471 | |
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基 | Welgene | LM001-05 |
| RNA干扰 | Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen | -- |
| 逆转录病毒感染 | Lipofectamine P3000 | Invitrogen | -- |
| 己二甲铵溴化物 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 划痕实验 | 细胞观察站 | Zeiss | -- |
| 免疫荧光 | 8孔玻璃载玻片 | Lab-Tek | 154534 |
| 免疫印迹 | RIPA裂解缓冲液 | CST | #5872 |
| Pierce BCA蛋白测定试剂盒 | Thermo Scientific | 23227 | |
| 免疫沉淀 | Dynabeads蛋白G | Thermo Scientific | 10004D |
| 正常兔IgG | CST | #2729 | |
| 免疫印迹 | 抗兔二抗（过氧化物酶偶联） | CST | #7074 |
| 抗小鼠二抗（过氧化物酶偶联） | CST | #7076 | |
| ECL免疫印迹检测液 | Millipore | WBKLS0500 | |
| 兔抗磷酸化MST1 (Thr183)多克隆抗体 | CST | #3681 | |
| 小鼠抗MST1单克隆抗体 | BD biosciences | #611052 | |
| 兔抗MST1单克隆抗体 | CST | #14946 | |
| 兔抗磷酸化LATS1 (Thr1079)单克隆抗体 | CST | #8654 | |
| 兔抗LATS1单克隆抗体 | CST | #3477 | |
| 兔抗磷酸化YAP (Ser127)多克隆抗体 | CST | #4911 | |
| 兔抗YAP单克隆抗体 | CST | #14074 | |
| 兔抗HIF1α单克隆抗体 | CST | #14179 | |
| 兔抗磷酸化AKT (Ser473)单克隆抗体 | CST | #4058 | |
| 兔抗AKT多克隆抗体 | CST | #9272 | |
| 兔抗磷酸化FOXO1 (Ser256)多克隆抗体 | CST | #9461 | |
| 兔抗磷酸化VEGFR2 (Tyr1175)单克隆抗体 | CST | #2478 | |
| 兔抗VEGFR2单克隆抗体 | CST | #2479 | |
| 兔抗磷酸化FOXO1 (Ser212)多克隆抗体 | Generated by Abclon | -- | |
| 兔抗FOXO1单克隆抗体 | CST | #2880 | |
| 兔抗β-actin单克隆抗体 | Sigma-Aldrich | A5441 | |
| 兔抗GAPDH单克隆抗体 | CST | #5174 | |
| 兔抗LAMIN B1多克隆抗体 | Abcam | ab16048 | |
| 兔抗GFP多克隆抗体 | Abcam | ab290 | |
| 小鼠抗FLAG单克隆抗体，辣根过氧化物酶偶联 | Sigma-Aldrich | A8592 | |
| 肺内皮细胞分离 | II型胶原酶 | Worthington | -- |
| Dispase | Gibco | 17105041 | |
| DNase I | Roche | -- | |
| 流式细胞术 | 大鼠抗CD31 APC标记抗体 | BD Biosciences | 561814 |
| 大鼠抗CD45 FITC标记抗体 | eBioscience | #11-0451-81 | |
| 大鼠抗TER119 FITC标记抗体 | eBioscience | #11-5921-82 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | -- | |
| RNA提取 | Trizol试剂 | Invitrogen | -- |
| RNeasy迷你试剂盒 | Qiagen | -- | |
| 逆转录 | GoScriptTM逆转录系统 | Promega | -- |
| qRT-PCR | FastStart SYBR Green Master | Roche | -- |
| QuantStudio3实时PCR仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| OIR模型 | O2控制体内培养箱 | COY laboratories | -- |
| 成像 | LSM880共聚焦显微镜 | Zeiss | -- |
| 脑切片 | VT1200 S振动切片机 | Leica | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 内皮特异性基因敲除小鼠 | 他莫昔芬剂量和给药途径：新生小鼠100 μg/天P1-P3腹腔注射；OIR模型200 μg/天P12-P14腹腔注射；成年小鼠2 mg/天连续5天腹腔注射 阅读提示：Methods中Mice and treatment小节 |
| 缺氧处理HUVEC | 缺氧条件为1% O2，处理时间点包括30分钟至36小时；VEGF 200 ng/ml处理30分钟；Trolox 1 mM；Rotenone 2.5 μM 阅读提示：Methods中Cell culture and treatment小节及Figure 5、6图注 |
| 划痕实验 | siRNA转染后48小时进行划痕；划痕后每10分钟拍摄一次，共15小时；用于免疫荧光的细胞在划痕后9小时固定 阅读提示：Methods中Wound scratch assay小节及Supplementary Fig. 8 |
| OIR模型 | P7小鼠暴露于75%氧气5天，然后室内空气5天；他莫昔芬P12-P14注射 阅读提示：Methods中OIR mouse model小节 |
| RNA测序 | siRNA转染后48小时，缺氧处理3小时；使用Illumina HiSeq 2500进行100 nt配对末端测序 阅读提示：Methods中RNA-sequencing analysis小节 |