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        利用三种小鼠囊胚来源干细胞生成的自组装胚样结构的植入起始

        Implantation initiation of self-assembled embryo-like structures generated using three types of mouse blastocyst-derived stem cells.

        作者信息Shaopeng Zhang, Tianzhi Chen, Naixin Chen, Dengfeng Gao, Bingbo Shi, Shuangbo Kong, Rachel Claire West, Ye Yuan, Minglei Zhi, Qingqing Wei, Jinzhu Xiang, Haiyuan Mu, Liang Yue, Xiaohua Lei, Xuepeng Wang, Liang Zhong, Hui Liang, Suying Cao, Juan Carlos Izpisua Belmonte, Haibin Wang, Jianyong Han
        PMID30700702
        期刊Nat Commun
        发布时间2019-01-30
        DOI10.1038/s41467-019-08378-9
        来源查看原文

        实验完整度

        高

        体外自组装模型结合基因敲除、单细胞qPCR、免疫染色及胚胎移植体内验证。

        主要模型

        小鼠ESC、TSC和XENC自组装ETX-embryoids EXE-embryoids（ESC与XENC） ETS-embryoids（ESC与TSC） 假孕小鼠子宫移植模型

        重点核对

        ETX-embryoids接种细胞数为1×10^5 ESCs、1×10^5 TSCs和2×10^5 XENCs，于3.5 cm非处理培养皿中60 rpm摇动培养 Nodal信号抑制使用10 μM SB431542处理84 h，并以Nodal-/- ESCs生成ETX-embryoids验证 36 h重建胚转移至2.5或3.5 dpc假孕CD1小鼠子宫，每受体移植16-20个胚胎 免疫染色检测Oct4、Gata4、Cdx2、Eomes、PCX、E-Cadherin、aPKC、Laminin、cleaved caspase-3等标志物 单细胞qPCR检测谱系标志物，并通过PLS-DA分析细胞群

        摘要

        由囊胚来源干细胞自组装形成的空间有序胚样结构可在体外模拟胚胎发生。然而，此类结构的组装体系和发育潜能仍需进一步研究。在此，我们设计了一种非粘附悬浮摇动体系，利用小鼠胚胎干细胞、滋养层干细胞和胚外内胚层干细胞生成自组装胚样结构（ETX-embryoids）。当三种细胞一起培养时，它们聚集并分选形成谱系特异性区室。这些区室间的信号传导产生分子和形态发生事件， closely mimic those observed in wild-type embryos。这些ETX-embryoids表现出腔化、中胚层和原始生殖细胞前体标志物的不对称基因表达模式，以及前部脏壁内胚层样组织的形成。移植到假孕小鼠子宫后，ETX-embryoids高效启动植入并触发蜕膜组织形成。三种细胞类型在体外自组装成胚样结构的能力为研究胚胎发生提供了强大的模型系统。

        实验结论

        提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。

        研究问题
        三种囊胚来源干细胞能否在体外自组装成模拟胚胎发生的胚样结构，并具备植入起始能力。
        核心机制
        ESC、TSC和XENC自组装形成谱系区室，区室间信号传导（包括ESC来源的Nodal信号）驱动腔化、DVE/AVE样组织形成及中胚层和PGC前体特化。
        主要证据
        ETX-embryoids显示腔化、Laminin基底膜、Lefty1不对称表达、Blimp1-mVenus中胚层/PGC前体样细胞；移植后启动植入并诱导蜕膜化，但发育潜能有限。
        研究意义
        该自组装体系为研究胚胎发生和植入后形态发生提供了强大的模型系统。

        研究路径

        按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

        1

        建立非粘附悬浮摇动自组装体系

        筛选适合三种干细胞聚集和自组装的培养条件。

        比较悬滴培养、微孔培养、微注射法和非粘附悬浮摇动培养，用DsRed-ESCs和EGFP-TSCs追踪细胞空间定位。

        2

        优化ETX-embryoids组装比例与效率

        确定三种细胞最佳起始数量和比例。

        混合ESCs、TSCs和XENCs，测试不同细胞数量、比例和培养基成分对规则结构形成效率的影响。

        3

        验证腔化和前羊膜腔形成

        检测重建胚是否发生极性和腔化。

        免疫染色检测PCX、E-Cadherin、aPKC、Laminin和cleaved caspase-3，追踪EXE-embryoids和ETX-embryoids腔形成过程。

        4

        验证Nodal信号依赖

        确定Nodal信号在ETX-embryogenesis腔化中的作用。

        使用TGF-beta受体抑制剂SB431542处理，并构建Nodal-/- ESCs生成ETX-embryoids，检测TSC区室腔化。

        5

        验证DVE/AVE样区域化

        检测XENC来源组织是否形成DVE/AVE样组织。

        使用Lefty1-mCherry XENCs生成ETX-embryoids，追踪Lefty1-mCherry阳性细胞分布和迁移，单细胞qPCR检测DVE/AVE标志物。

        6

        验证中胚层和PGC前体特化

        检测ETX-embryoids中是否发生中胚层诱导和PGC前体特化。

        使用Blimp1-mVenus和Stella-ECFP（BVSC）双转基因ESC系生成ETX-embryoids，免疫染色和单细胞qPCR检测Blimp1、Cripto等标志物。

        7

        体内移植验证植入起始

        检测ETX-embryoids能否在假孕小鼠子宫启动植入。

        将36 h ETX-embryoids、ETS-embryoids和EXE-embryoids转移至2.5或3.5 dpc假孕CD1小鼠子宫，观察植入位点、蜕膜组织和胚胎结构。

        研究方法

        按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。

        验证样本或模型特征
        免疫荧光染色共聚焦显微镜苏木精-伊红染色原位杂交
        验证分子表达变化
        单细胞定量PCR逆转录定量PCR
        验证机制链路
        CRISPR-Cas9基因敲除药理学抑制Sleeping Beauty转座子系统
        评估体内效果
        胚胎移植植入位点评估
        数据分析与统计
        偏最小二乘判别分析双尾Student t检验层次聚类

        产品清单

        实验环节名称品牌货号
        细胞培养DMEM培养基Thermo Fisher Scientific11960069
        advanced RPMI 1640培养基Thermo Fisher Scientific11875-093
        胎牛血清Gibco--
        GlutaMAX添加剂Thermo Fisher Scientific35050061
        β-巯基乙醇Thermo Fisher Scientific21985-023
        MEM非必需氨基酸Thermo Fisher Scientific11140050
        青霉素-链霉素Thermo Fisher Scientific15140122
        白血病抑制因子Miltenyi Biotec130-099-895
        PD0325901Tocris4423
        CHIR99021Tocris4192
        重组人FGF4R&D235-F4-025
        肝素Stem Cell07980
        细胞传代TrypLE消化酶Thermo Fisher Scientific12605010
        0.1%胰蛋白酶-EDTAThermo Fisher Scientific25300054
        细胞培养磷酸盐缓冲液Gibco14190-094
        质粒构建NEBuilder HiFi DNA组装预混液NEW ENGLAND BioLabs--
        Lipofectamine 3000转染试剂Thermo Fisher ScientificL3000001
        JetPrime转染试剂Polyplus transfection114-15
        免疫荧光染色Triton X-100PromegaH5142
        含DAPI的Fluoroshield封片剂abcam104140
        免疫组化染色兔抗CK抗体Abcamab9377
        兔抗COX2抗体Abcamab15191
        兔抗Laminin抗体SigmaL9393
        山羊抗Gata4抗体Santa Cruzsc-1237
        鼠抗PL1抗体Santa Cruzsc-376436
        原位杂交抗DIG抗体Sigma-Aldrich--
        胚胎移植M2培养基MilliporeMR-015-D
        胚胎培养KSOM培养基MilliporeMR-020P-5F
        DNA提取TIANamp微量DNA提取试剂盒TiangenDP316

        关键环节

        汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

        环节核对要点
        ETX-embryoids自组装
        ESCs 1×10^5、TSCs 1×10^5、XENCs 2×10^5；3.5-cm非处理培养皿；60 rpm摇动；36-84 h
        阅读提示：Methods“Generation of self-assembled embryos”及Supplementary Fig. 3a–e
        Nodal信号抑制
        SB431542浓度10 μM；处理84 h；Nodal-/- ESCs构建方式
        阅读提示：Results“ETX-embryogenesis requires Nodal signaling”及Fig. 4
        胚胎移植
        36 h重建胚；2.5或3.5 dpc假孕CD1小鼠；每受体16-20个胚胎；移植后48、72、84 h检测
        阅读提示：Methods“Embryo transfer and implantation evaluation”及Fig. 7
        单细胞qPCR
        单细胞分离时间点0、24、84 h；背景Ct值26；引物列表见Supplementary Data 1
        阅读提示：Methods“High-throughput single-cell qPCR and data processing”

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