构建同源敲除细胞系并验证
建立研究BAP1及ASXL功能的细胞模型
在HAP1细胞中用CRISPR/Cas9插入STOP盒构建BAP1、ASXL1、ASXL2、EZH2等基因敲除，RT-qPCR验证并检测增殖
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BAP1复合物通过拮抗PRC1介导的H2A泛素化促进转录
BAP1 complex promotes transcription by opposing PRC1-mediated H2A ubiquitylation.
实验完整度
高含CRISPR/Cas9同源KO细胞系、RNA-seq、ChIP-seq、质谱、回补实验及多基因双/三敲功能验证
主要模型
人HAP1细胞（近单倍体） HeLa-S3细胞 Uveal Melanoma MP41细胞 HEK-293细胞ChIP-seq数据
重点核对
HAP1细胞中BAP1、ASXL1、ASXL2、EZH2、RING1A、SMARCB1的CRISPR/Cas9敲除及RT-qPCR验证 BAP1 KO与ASXL1/2双KO细胞中H2A泛素化水平及BAP1蛋白稳定性检测 BAP1 KO细胞中回补野生型或C91S催化失活BAP1后的转录恢复 RING1A/B双KO及RING1A/B;BAP1三KO中H2AK119ub1与基因表达检测 RA处理时间进程下RARβ和CYP26A1表达检测
摘要
在果蝇中，由Calypso和ASX组成的复合物催化H2A去泛素化，并据报道作为Polycomb机制的一部分参与转录沉默。这些蛋白在哺乳动物中的同源物（分别为BAP1和ASXL1/2/3）在多种癌症类型中频繁突变，但其确切功能仍不清楚。利用基于CRISPR/Cas9构建的同源细胞系的整合方法，我们发现了BAP1在基因激活中一个意想不到的作用。该功能需要组装一个包含一种冗余ASXL蛋白的酶活性BAP1相关核心复合物（BAP1.com）。我们研究了BAP1.com介导的转录调控机制，并表明它不参与Polycomb介导的沉默。相反，我们的结果确立了BAP1.com的功能是保护转录活跃基因免受Polycomb Repressive Complex 1的沉默。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- BAP1及其与ASXL蛋白组成的复合物在转录调控中的作用及其与Polycomb沉默机制的关系。
- 核心机制
- BAP1.com通过其去泛素化酶活性去除PRC1介导的H2AK119ub1，从而拮抗PRC1的沉默作用以促进转录；PRC1对BAP1呈上位性。
- 主要证据
- HAP1同源KO细胞系的RNA-seq显示BAP1缺失主要导致基因下调；ChIP-seq显示H2AK119ub1广泛增加；BAP1 C91S回补不能恢复转录；RING1A/B缺失后BAP1功能丧失。
- 研究意义
- 为BAP1.com功能提供机制见解，并为靶向该染色质修饰复合物异常的肿瘤提供新策略方向。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
转录组分析BAP1及ASXL缺失效应
确定BAP1缺失对基因表达的方向性影响
对野生型及各KO细胞进行RNA-seq，鉴定差异表达基因并做GO富集分析
鉴定BAP1核心复合物组成
确定BAP1稳定结合的伴侣蛋白
在HeLa细胞过表达Flag-BAP1/ASXL1/ASXL2后进行免疫共沉淀和质谱，并用离子交换与分子筛层析分析洗脱模式
检测BAP1与ASXL对H2A泛素化的调控
验证复合物对H2AK119ub1的调控及ASXL冗余性
Western blot检测各KO中H2A泛素化水平，构建ASXL1/2双KO检测BAP1蛋白稳定性
分析BAP1与Polycomb机制的关系
检验BAP1是否参与Polycomb介导的沉默
构建RING1B、EZH2 KO及BAP1/EZH2双KO，RNA-seq与ChIP-seq分析H2AK119ub1和H3K27me3分布
检测BAP1在转录激活刺激下的作用
评估BAP1在RA诱导转录激活中的功能
RA处理时间进程检测RARβ和CYP26A1表达，并对RA处理24小时后的细胞做RNA-seq
验证BAP1催化活性及PRC1上位性
确定DUB活性必要性及H2AK119ub1依赖性
在BAP1 KO中回补WT或C91S BAP1；构建RING1A/B dKO及RING1A/B;BAP1 tKO并检测转录
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Iscove改良Dulbecco培养基 | -- | -- |
| Dulbecco改良Eagle培养基 | -- | -- | |
| SF-900 II无血清培养基 | Invitrogen | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Invitrogen | -- | |
| 两性霉素B | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| L-谷氨酰胺 | -- | -- | |
| 转染与感染 | 聚凝胺 | -- | -- |
| RT-qPCR | High Capacity cDNA逆转录试剂盒 | Applied Biosystems | 4368814 |
| SYBR green试剂 | Roche | -- | |
| ViiA7仪器 | Applied Biosystems | -- | |
| 细胞计数 | Vi-cells细胞计数仪 | Beckman-Coulter | -- |
| 流式分选 | CD25-FITC抗体 | BD Biosciences | 553866 |
| ChIP | Bioruptor超声破碎仪 | Diagenode | -- |
| 质谱 | 抗FLAG M2亲和凝胶 | -- | -- |
| Flag肽 | -- | -- | |
| 胰蛋白酶/Lys-C | Promega | -- | |
| Orbitrap Fusion质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| RSLCnano系统（Ultimate 3000） | Thermo Scientific | -- | |
| 层析 | HiTrap SP HP 5 ml柱 | GE Healthcare | -- |
| Superose 6 PC3.2 increase柱 | GE Healthcare | -- | |
| Western blot | BAP1抗体（C-4） | Santa-Cruz | sc-28383 |
| FOXK1抗体（G-4） | Santa-Cruz | sc-373810 | |
| YY1抗体 | Santa-Cruz | sc-7341 | |
| RAR-alpha抗体 | Santa-Cruz | sc-551 | |
| FLAG抗体（M2） | Sigma | F1804 | |
| HCFC1抗体 | Bethyl Laboratories | A301-400A | |
| RNF2抗体 | Bethyl Laboratories | A302-869A | |
| Lamin B1抗体 | -- | ab16048 | |
| RING1A抗体 | Cell Signaling Technology | 2820S | |
| RING1B抗体（D22F2） | Cell Signaling Technology | 5694S | |
| H2AK119ub1抗体（D27C4） | Cell Signaling Technology | 8240S | |
| H3K27me3抗体（C36B11） | Cell Signaling Technology | 9733S | |
| H3K4me3抗体（C42D8） | Cell Signaling Technology | 9751 | |
| H4抗体 | Cell Signaling Technology | 2935S | |
| H2A.Z抗体 | Active Motif | 39113 | |
| H2B抗体（5HH2-2A8） | Active Motif | 61037 | |
| H2BK120ub抗体（C56） | Active Motif | 39623 | |
| H3抗体（C端） | Active Motif | 39163 | |
| KDM1B抗体 | Active Motif | 61457 | |
| H3K4me2抗体 | Cosmo Bio | MCA-MAB10003-100-Ex | |
| alpha-Tubulin抗体（1F4E3） | Genscript | A01410 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞系与敲除构建 | HAP1细胞来源、CRISPR/Cas9 STOP盒策略、各基因KO克隆选择及RT-qPCR/western blot验证 阅读提示：Methods中Constitutive KOs in HAP1 cell line小节 |
| RNA-seq与差异表达分析 | 生物学重复数、测序平台HiSeq 2500、差异基因阈值FDR<0.05且绝对log2 fold-change>1 阅读提示：Methods中RNA sequencing与Differential expression analysis小节 |
| ChIP-seq分析 | 抗体用量约2 μg、染色质10 μg、Sonication设备及H2AK119ub1差异分析SICER参数 阅读提示：Methods中Chromatin immunoprecipitation与ChIP sequencing小节 |
| 回补实验 | BAP1 WT与C91S回补的逆转录病毒感染条件、Polybrene浓度8 μg/ml及嘌呤霉素筛选 阅读提示：Methods中Rescue experiment (BAP1 WT and C91S)小节 |
| RA处理转录激活实验 | RA处理时间点、RNA-seq处理24小时及RT-qPCR检测基因 阅读提示：Results中Similarities between BAP1.com and general co-activators及Fig. 5a、5b |