建立CYPJ对NF-κB通路的负调控表型
验证CYPJ是否抑制NF-κB活化及其在通路中的作用位置
在293T细胞中进行荧光素酶报告基因筛选，过表达或CRISPR-Cas9敲除CYPJ后检测TNF诱导的NF-κB报告基因活性、TNF和IL-8转录、IKKα/β与IкBα磷酸化及p65核转位
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亲环素J通过阻断泛素链感知限制炎症
Cyclophilin J limits inflammation through the blockage of ubiquitin chain sensing.
实验完整度
高涵盖293T/HeLa细胞系、CRISPR敲除、原代mBMM、Cypj敲除小鼠及脓毒症与DSS结肠炎模型，含功能与机制验证
主要模型
293T与HeLa细胞系 CRISPR-Cas9敲除CYPJ的293T细胞 小鼠原代骨髓来源巨噬细胞（mBMM） Cypj敲除C57BL/6小鼠及其LPS/HKLM脓毒症与DSS结肠炎模型
重点核对
CYPJ敲除或回补后TNF诱导的NF-κB报告基因活性及TNF、IL-8转录变化 LPS 100 ng ml−1、TNF 20 ng ml−1或HKLM 107 CFU ml−1处理mBMM后Ikkα/β、IкBα、Jnk、p38磷酸化与Tnf、Il-6转录 GST pull-down与co-IP验证CYPJ片段3及TAB2/3 NZF结构域结合，ITC检测直接结合 K63泛素链与TAB2/3-NZF结合实验及CYPJ-Δ3缺失片段的阻断能力 LPS 10 mg kg−1腹腔注射后小鼠生存率（每组6只）与DSS 3%结肠炎体重和结肠长度（每组5只）
摘要
维持先天免疫稳态对个体健康至关重要。据报道，Npl4锌指（NZF）结构域介导的泛素链感知在核因子-κB（NF-κB）信号通路中发挥作用，但其调控机制仍不清楚。本研究表明，肽基脯氨酰异构酶家族成员亲环素J（CYPJ）受炎症诱导。CYPJ与转化生长因子-β激活激酶1结合蛋白2和3的NZF结构域以及线性泛素链组装复合物的组分相互作用，阻断泛素链的结合，并负调控NF-κB信号传导。Cypj缺陷小鼠对脂多糖和热灭活单核细胞增生李斯特菌诱导的脓毒症以及葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎易感。这些发现将CYPJ鉴定为NF-κB信号通路的负反馈调节因子，并为理解先天免疫稳态提供了见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 阐明肽基脯氨酰异构酶家族成员CYPJ在先天免疫NF-κB信号通路中的调控作用及其机制。
- 核心机制
- CYPJ通过其C端片段3结合TAB2/3及LUBAC组分的NZF结构域，阻断K63泛素链与TAB2/3的结合并抑制LUBAC活性，从而负反馈抑制NF-κB信号。
- 主要证据
- 293T细胞报告基因、co-IP、GST pull-down、ITC和泛素链结合实验显示CYPJ结合TAB2/3 NZF并阻断K63泛素链感知；Cypj敲除mBMM中Ikkα/β、IкBα及Jnk、p38磷酸化增强；Cypj缺陷小鼠对LPS、HKLM脓毒症和DSS结肠炎更易感。
- 研究意义
- 将CYPJ鉴定为NF-κB通路的负反馈调节因子，为理解先天免疫稳态提供机制见解，并提示其作为抗炎药物研发潜在靶点的可能。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
在炎症刺激下检测CYPJ表达
验证CYPJ是否受炎症刺激诱导
检测TNF处理的HeLa细胞、LPS处理的mBMM和VSV感染的A549细胞中CYPJ与CYPA蛋白及mRNA水平
在Cypj敲除小鼠原代巨噬细胞中验证负调控作用
确认Cypj在体内来源原代细胞中抑制NF-κB及促炎因子表达
利用CRISPR-Cas9编辑小鼠Cypj第三外显子制备敲除小鼠，分离mBMM并以LPS、Tnf、HKLM、Il-1β刺激，检测Ikkα/β、Ikbα、Jnk、p38磷酸化及Tnf、Il-6转录
鉴定CYPJ与TAB2/3的结合及关键结构域
确定CYPJ在NF-κB通路中的靶蛋白及结合区域
通过共转染报告基因、co-IP、GST pull-down、免疫荧光共定位和ITC检测CYPJ与TAB2/3及LUBAC组分NZF结构域的结合，并定位CYPJ片段3和TAB2 NZF结构域
验证CYPJ阻断K63泛素链感知
证明CYPJ干扰K63泛素链与TAB2/3 NZF结构域的结合
在293T细胞中共转染Flag-TAB2与HA-K63-Ub并检测泛素化信号，使用体外合成的His-K63-Ub链进行免疫沉淀和GST pull-down，检测CYPJ及CYPJ-Δ3的阻断能力
体内评估Cypj对炎症的保护作用
评估Cypj在脓毒症和结肠炎模型中的生理意义
对WT和Cypj敲除小鼠腹腔注射LPS或HKLM观察生存率与血清Tnf，并以3% DSS饮水诱导结肠炎检测体重、结肠长度与组织病理
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
验证细胞功能变化
验证泛素链感知
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | 大肠杆菌011:B4脂多糖 | Sigma-Aldrich | L2630 |
| 细胞培养 | 鼠巨噬细胞集落刺激因子 | Reprotech | AF-315-02 |
| 细胞处理 | 鼠肿瘤坏死因子 | Reprotech | AF-315-01 |
| 鼠白细胞介素-1β | Reprotech | AF-211-11B | |
| 动物实验 | 葡聚糖硫酸钠 | MP Biomeicals | 160110 |
| ELISA | 酶联免疫吸附测定试剂盒 | R&D Systems | -- |
| 细胞培养 | 胎牛血清 | Gibco | 10270-106 |
| Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | thermo fisher scientific | -- | |
| 质粒转染 | DNA转染试剂 | Bimake | B35101 |
| Western blot | CYPJ/PPIL3抗体 | Abcam | ab169936 |
| K63连接泛素特异性抗体 | Abcam | ab179434 | |
| TAB3抗体 | Abcam | ab85655 | |
| PPIL3 C端抗体 | ABGENT | AP17078b | |
| 泛素链实验 | His6标记K63连接多聚泛素链 | Boston Biochem, R&D systems | UCH-330 |
| Western blot | 抗Flag抗体 | Sigma | F3165 |
| CYPA抗体 | Cell Signaling Technology | #2175 | |
| 磷酸化IKKα/β抗体 | Cell Signaling Technology | #2697 | |
| 磷酸化IκBα抗体 | Cell Signaling Technology | #9246 | |
| 磷酸化p38抗体 | Cell Signaling Technology | #4511 | |
| Erk1/2抗体 | Cell Signaling Technology | #46955 | |
| 磷酸化Erk1/2抗体 | Cell Signaling Technology | #4370 | |
| 磷酸化JNK抗体 | Cell Signaling Technology | #4668 | |
| JNK抗体 | Cell Signaling Technology | #9252 | |
| 细胞刺激 | 人肿瘤坏死因子-α | Cell Signaling Technology | #8902 |
| 细胞裂解 | 细胞裂解液（10×） | Cell Signaling Technology | #8903 |
| RIPA裂解液（10×） | Cell Signaling Technology | #8906 | |
| Western blot | c-Myc抗体 | Santa Cruz Biotechnology | SC-40 |
| HA探针抗体 | Santa Cruz Biotechnology | SC-7392 | |
| β-肌动蛋白抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47778 | |
| 泛素抗体 | Santa Cruz Biotechnology | SC-8017 | |
| IKKα/β抗体 | Santa Cruz Biotechnology | SC-7607 | |
| TAB2抗体 | Santa Cruz Biotechnology | SC-11851 | |
| GAPDH抗体 | New Progress Biotechnology | RM2002V | |
| β-微管蛋白抗体 | New Progress Biotechnology | RM2003V | |
| His抗体 | New Progress Biotechnology | RM1001V | |
| Myc抗体 | New Progress Biotechnology | RM1003V | |
| HA抗体 | New Progress Biotechnology | RM1004V | |
| Myc抗体 | Genscript | A00172 | |
| HA抗体 | Genscript | A00168 | |
| NF-κB-P65抗体 | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology | ZS-8008 | |
| p38抗体 | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology | ZS-71490 | |
| GFP抗体 | Proteintech | 66002-1-Ig | |
| GFP抗体 | Proteintech | 50430-2-AP | |
| β-肌动蛋白抗体 | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| TAB2抗体 | Proteintech | 14410-1-AP | |
| PCNA抗体 | Proteintech | 60097-1-Ig | |
| 免疫荧光 | RELA/p65单克隆抗体 | Abclonal | A10609 |
| 免疫沉淀 | 谷胱甘肽Sepharose 4B | GE Healthcare | 17-0756-01 |
| 蛋白G磁珠 | Santa Cruz Biotechnology | SC-2002 | |
| 免疫荧光 | DAPI染色试剂盒 | KeyGEN Biotechnology | KGA215 |
| Western blot | 蛋白Marker | Genstar | M221 |
| 报告基因实验 | 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | -- |
| 核质分离 | 细胞质与细胞核分离试剂盒 | Beyotime | A00172 |
| Western blot | 5×双载样缓冲液 | FDbio science | FD006 |
| Super ECL检测试剂 | KeyGEN Biotechnology | -- | |
| 流式细胞术 | CD3e抗体 | eBioscience | 45-0031-82 |
| CD8a抗体 | eBioscience | 25-0081-82 | |
| CD19抗体 | eBioscience | 17-0193-82 | |
| NKP46抗体 | eBioscience | 12-3351-82 | |
| NK1.1抗体 | BD | 561111 | |
| CD11c抗体 | BD | 560584 | |
| MHCII抗体 | BD | 562352 | |
| F4/80抗体 | Biolegend Biosciences | 123116 | |
| CD11b抗体 | Biolegend Biosciences | 101208 | |
| 细胞刺激 | 热灭活单核细胞增生李斯特菌 | InvivoGen | tlrl-hklm |
| qRT-PCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| EasySript一步法gDNA去除与cDNA合成试剂盒 | TRANSGEN | AE311 | |
| 通用iQ SYBR Green预混液 | Bio-Rad | -- | |
| 蛋白纯化 | Ni-NTA His结合树脂 | 7sea Biotech | PAN001-001C |
| 等温滴定量热 | MicroCal iTC200等温滴定量热仪 | GE Healthcare | -- |
| 免疫荧光 | 激光共聚焦荧光显微镜 | ZEISS | LSM880 |
| 质粒构建 | pcDNA3.0/Flag质粒 | Invitrogen | -- |
| pGEX-4T-1载体 | GE Healthcare | -- | |
| pEGFP-N1载体 | CLONTECH Laboratories | -- | |
| CRISPR敲除 | lentiCRISPR V2载体 | Addgene | 52961 |
| 基因组DNA提取 | 基因组DNA提取试剂盒 | TIANGEN | DP304 |
| Western blot | Immobilon Western HRP底物 | Millipore | -- |
| ChemiDoc Touch成像仪 | Bio-Rad | -- | |
| 细胞培养 | Plasmocin支原体清除剂 | -- | ant-mpt |
| 流式细胞术 | BD LSRFortessa X-20细胞分析仪 | BD | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CYPJ对NF-κB报告基因的调控 | 细胞系（293T）、TNF处理浓度与时间、转染质粒量、报告基因实验重复数N=3 阅读提示：Fig. 1a–d图注及Dual-luciferase reporter assay方法小节 |
| mBMM中NF-κB与JNK通路激活 | LPS 100 ng ml−1、Tnf 20 ng ml−1、HKLM 107 CFU ml−1及处理时间点、qRT-PCR重复数N=3 阅读提示：Fig. 2d–i图注及Mice、Cell culture and transfection方法小节 |
| CYPJ与TAB2/3 NZF结构域结合 | GST融合蛋白片段、E.coli BL21表达条件、ITC所用NZF肽序列与His-CYPJ 阅读提示：Fig. 3、Fig. 4图注及GST pull-down assay、ITC assay方法小节 |
| K63泛素链与TAB2/3结合 | His-K63-Ub链用量（约1 μg）、Flag-TAB2转染24 h、抗His免疫沉淀条件 阅读提示：Fig. 5图注及Polyubiquitin chain assay方法小节 |
| 小鼠脓毒症与结肠炎模型 | LPS 10 mg kg−1或5/50 mg kg−1序贯、HKLM 2×1012 CFU每只、3% DSS、每组小鼠数、6–8周龄 阅读提示：Fig. 7图注及Mice方法小节 |