PKM2敲低效率验证
确认siRNA特异性敲低PKM2或pan-PKM的效果
在HUVECs中转染靶向PKM2或pan-PKM的siRNA，通过RT-qPCR和Western blot检测敲低效率。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
丙酮酸激酶M2缺失限制内皮细胞生长并触发先天免疫信号
Loss of pyruvate kinase M2 limits growth and triggers innate immune signaling in endothelial cells.
实验完整度
高包含体外HUVEC、斑马鱼和小鼠模型，并有功能验证及机制验证
主要模型
原代人脐静脉内皮细胞（HUVECs） 斑马鱼pkma2/pkmb突变体 小鼠内皮细胞特异性Pkm2条件性敲除模型 小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs，仅提及）
重点核对
PKM2 siRNA敲低效率（RT-qPCR和Western blot验证） HUVECs中[U-13C6]-glucose标记的代谢流分析 斑马鱼pkma2mz/pkmb−/−突变体ISV形成缺陷 小鼠Pkm2iEC-KO视网膜血管发育缺陷 RELB/P53敲低对PKM2KD细胞周期阻滞的挽救
摘要
尽管内皮细胞（ECs）天然邻近循环中的氧气和营养物质，但ECs在线粒体中仅氧化一小部分葡萄糖，这种代谢特化现象尚不清楚。在此，我们展示糖酵解酶丙酮酸激酶M2（PKM2）限制葡萄糖氧化，并维持ECs的生长和表观遗传状态。我们发现PKM2缺失改变线粒体底物利用，并在体内损害EC增殖和迁移。机制上，我们表明NF-κB转录因子RELB对PKM2缺失有响应，通过调控P53限制EC生长。此外，缺乏PKM2时S-腺苷甲硫氨酸合成受损，导致DNA低甲基化、内源性逆转录病毒元件（ERVs）去抑制和抗病毒先天免疫信号激活。这项工作揭示了内皮中葡萄糖氧化的代谢和功能后果，强调了PKM2对 endothelial 生长的重要性，并将代谢功能障碍与ECs中的自身免疫激活联系起来。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- PKM2在内皮细胞葡萄糖氧化、生长和表观遗传状态中的作用及其分子机制是什么？
- 核心机制
- PKM2缺失通过RELB-P53信号限制内皮生长，并减少SAM合成导致DNA低甲基化、ERV去抑制和先天免疫信号激活。
- 主要证据
- HUVECs中PKM2敲低改变线粒体代谢、抑制增殖和迁移；斑马鱼和小鼠内皮特异性Pkm2缺失导致血管生成缺陷；RELB或P53敲低挽救细胞周期阻滞；PKM2缺失降低SAM、DNA甲基化并增加dsRNA和ISG表达。
- 研究意义
- 揭示内皮细胞中葡萄糖氧化的代谢和功能后果，强调PKM2对血管内皮生长和稳态的重要性，并将代谢功能障碍与内皮细胞自身免疫激活联系起来。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
代谢流和线粒体功能分析
评估PKM2缺失对葡萄糖代谢和线粒体呼吸的影响
使用[U-13C6]-glucose进行代谢流分析，Seahorse分析ECAR和OCR，检测TCA循环中间产物和ROS水平。
内皮细胞功能验证
检测PKM2缺失对EC增殖和迁移的影响
EdU掺入、pHH3染色、细胞计数、划痕实验。
斑马鱼体内血管发育分析
在体内验证Pkm2对血管生成的影响
生成pkma2和pkmb突变体，分析48 hpf胚胎ISV形成。
小鼠视网膜血管生成分析
在内皮细胞特异性敲除Pkm2的小鼠中验证血管生成缺陷
Pkm2flox与Pdgfb-CreERT2杂交，P1-P3注射4-OHT，P7分析视网膜血管。
RELB-P53机制验证
验证RELB和P53在PKM2缺失诱导的生长抑制中的作用
共转染PKM2与RELB或P53 siRNA，检测EdU/pHH3阳性细胞和Western blot。
SAM和DNA甲基化分析
检测PKM2缺失对一碳代谢和DNA甲基化的影响
代谢组学检测SAM/SAH，5mC定量，亚硫酸氢盐测序分析ERV位点甲基化。
ERV和先天免疫信号检测
验证PKM2缺失通过DNA低甲基化激活ERV和ISG表达
RT-qPCR检测ERV和ISG，J2抗体检测dsRNA，Western blot和RNA-seq分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 内皮基础培养基-2 | Lonza | -- |
| Dulbecco改良Eagle培养基 | -- | -- | |
| RNA干扰 | Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Invitrogen | -- |
| ON-TARGETplus非靶向对照池 | Dharmacon | -- | |
| Mission esiRNA | Sigma | -- | |
| RT-qPCR | miRNeasy微量RNA提取试剂盒 | Qiagen | -- |
| Maxima第一链cDNA合成试剂盒 | Thermo | -- | |
| Western blot | PKM1抗体 | Cell Signaling Technology | 7067 |
| PKM2抗体 | Cell Signaling Technology | 4053 | |
| P21抗体 | Cell Signaling Technology | 2947 | |
| P53抗体 | Cell Signaling Technology | 9282 | |
| P53抗体 | Santa Cruz | sc-126 | |
| RELB抗体 | Cell Signaling Technology | 10544 | |
| MAT2A抗体 | Novus Biologicals | NB110-94158 | |
| β-肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 8457 | |
| GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 2118 | |
| 抗兔IgG-HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | |
| Clarity Western ECL底物 | Biorad | -- | |
| 代谢分析 | Seahorse XFe96分析仪 | Seahorse Bioscience | -- |
| 糖酵解压力测试试剂盒 | -- | -- | |
| 线粒体压力测试试剂盒 | -- | -- | |
| 乳酸检测 | 乳酸检测试剂盒 | Biovision | -- |
| 葡萄糖摄取 | 2-NBDG | Life Technologies | -- |
| 免疫染色 | 磷酸化组蛋白H3抗体 | Cell Signaling Technology | 9713 |
| J2A抗体 | Scicons | -- | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 647成像试剂盒 | Thermo | -- | |
| 细胞周期分析 | 碘化丙啶 | Sigma-Aldrich | -- |
| 核糖核酸酶 | Sigma-Aldrich | R6513 | |
| 代谢组学 | [U-13C6]葡萄糖 | Cambridge Isotope Laboratories, Inc | -- |
| 蛋白组学 | DCA蛋白测定试剂盒 | -- | -- |
| 胶体蓝染色试剂盒 | Invitrogen | -- | |
| DNA甲基化分析 | MethylFlash甲基化DNA定量试剂盒 | Epigenetik | -- |
| ChIP | truChIP染色质剪切试剂盒 | Covaris | -- |
| 小鼠IgG | Cell Signaling | 5441S | |
| 组蛋白H3三甲基K9抗体 | Abcam | ab8898 | |
| 亚硫酸氢盐转化 | DNeasy血液和组织试剂盒 | Qiagen | 69504 |
| EpiJET亚硫酸氢盐转化试剂盒 | Thermo Scientific | K1461 | |
| Phusion U热启动DNA聚合酶 | Thermo Scientific | F555S | |
| 小鼠实验 | 4-羟基他莫昔芬 | Sigma | H6278 |
| 视网膜免疫染色 | PECAM抗体 | R&D Systems | AF3628 |
| ERG抗体 | Abcam | ab92513 | |
| IV型胶原蛋白抗体 | AbD Serotec | 2150-1470 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| HUVECs培养与siRNA转染 | HUVECs来源（Lonza或Life Technologies）、使用至第4代、siRNA序列（PKM2_si156:ccauaaucguccucaccaa）、转染试剂Lipofectamine RNAiMAX、转染后24小时重新接种、48小时检测 阅读提示：Methods中Cell culture和RNA interference小节 |
| 代谢流分析 | [U-13C6]glucose 50:50标记、LC-HRMS参数、Seahorse分析中葡萄糖10 mM、oligomycin 3 µM、FCCP 1 µM、antimycin A/rotenone 1.5/3 µM 阅读提示：Methods中LC-HRMS metabolomics and flux analysis和Seahorse metabolic analysis小节 |
| 斑马鱼突变体分析 | TALEN和CRISPR/Cas9靶点序列、注射量（TALEN每臂50 pg，sgRNA 50 pg + Cas9 mRNA 250 pg）、48 hpf检测ISV、n=8 阅读提示：Methods中Generation of zebrafish mutants with TALENs and CRISPR/Cas9小节及Figure 2 legend |
| 小鼠视网膜血管生成 | 4-OHT剂量（25 µl，2 mg/ml）和注射时间（P1-P3）、P7取材、视网膜染色抗体（PECAM 1:200，ERG 1:200，Collagen IV 1:400）、n=6 阅读提示：Methods中Mouse experiments和Immunostaining and analysis of postnatal retinas小节 |
| RELB/P53敲低挽救实验 | siRNA共转染策略、检测时间48小时、EdU/pHH3染色、Western blot抗体稀释比 阅读提示：Methods中RNA interference和Immunostaining of cell cultures小节及Figure 5 legend |
| DNA甲基化和ERV分析 | 5mC定量试剂盒、亚硫酸氢盐转化试剂盒、PCR引物序列、限制性内切酶（HpyCH4III for MER4D, HincII for MLT1B）、消化时间8小时 阅读提示：Methods中5-methylcytosine quantification和Bisulfite conversion and restriction analyses小节 |