Act1与STAT3相互作用的鉴定
验证Act1是否与STAT3直接结合并确定结合区域
HeLa细胞转染Act1-Flag后进行抗Flag免疫沉淀和质谱分析；共转染V5-Act1与Flag-STAT3进行Duolink邻近连接实验；WT小鼠naive T细胞经IL-6+IL-23极化后抗Act1免疫沉淀和western分析；转染Act1缺失突变体定位与STAT3结合所需氨基酸区域
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Act1通过直接抑制STAT3在T细胞和B细胞中作为负调控因子
Act1 is a negative regulator in T and B cells via direct inhibition of STAT3.
实验完整度
高含质谱、共免疫沉淀、邻近连接、Th17极化、基因敲除小鼠自身免疫表型及抗IL-21体内治疗等多层级功能与机制验证。
主要模型
Act1−/− C57BL/6J小鼠 Act1−/−Il23r−/−与Act1−/−Il21r−/−小鼠 小鼠脾脏原代CD4+ T细胞与B220+ B细胞 Act1D10N/D10N人PBMC
重点核对
Act1−/− C57BL/6J小鼠在8月龄用于自身免疫表型检测，Balb/c Act1−/−小鼠4月龄起用于抗IL-21治疗 Naive CD4+ T细胞经IL-23（10 ng/ml）+IL-6（10 ng/ml）极化Th17 3天，抗CD3 1 μg/ml与抗CD28 2 μg/ml包板 抗IL-21中和抗体0.5 mg/只腹腔注射，隔日一次，持续3个月，对照为IgG Th17细胞与B细胞共培养：MOG35–55（2 μg/ml或2 ng/ml）、抗IFNγ 10 μg/ml、抗IL-4 10 μg/ml，CFSE标记检测B细胞增殖 数据以mean±SEM表示，两组比较用双尾Student’s T检验，N=3–7/组，至少两次独立实验
摘要
尽管Act1（IL-17受体的衔接蛋白）对IL-17介导的炎症反应是必需的，但Act1缺陷（而非Il17ra、Il17rc或Il17rb缺陷）小鼠会自发发生SLE样和Sjögren样疾病。在此，我们证明Act1通过直接抑制STAT3在T细胞和B细胞中发挥负调控作用。质谱分析检测到Act1–STAT3复合物，Act1缺陷（而非Il17ra、Il17rc或Il17rb缺陷）分别导致T细胞和B细胞中IL-23和IL-21诱导的STAT3过度激活。在Act1−/−小鼠中，敲除IL-23R或阻断IL-21可改善SLE样和Sjögren样疾病。Act1缺陷导致滤泡Th17细胞过度活化，IL-21表达升高，从而促进T–B细胞相互作用，导致B细胞扩增和抗体产生。此外，抗IL-21可改善Act1缺陷小鼠的SLE样和Sjögren样疾病。因此，IL-21阻断抗体可能是治疗携带Act1突变患者SLE样和Sjögren样综合征的有效疗法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Act1缺陷导致SLE样和Sjögren样自身免疫疾病的分子机制是什么，该过程是否依赖IL-17信号，以及过度活化的Th17反应是否为其所必需。
- 核心机制
- Act1通过其300–309位氨基酸残基与未磷酸化STAT3直接结合，竞争性减弱STAT3向IL-23R和IL-6R（T细胞）及IL-21R（B细胞）的募集，从而负调控IL-23/IL-6及IL-21诱导的STAT3激活；Act1缺陷导致Th17来源IL-21升高，促进T–B细胞相互作用、B细胞扩增和抗体产生，驱动自身免疫。
- 主要证据
- 质谱和共免疫沉淀及邻近连接实验检测到Act1–STAT3相互作用；Act1缺陷（而非Il17ra、Il17rc、Il17rb缺陷）增强T、B细胞中IL-23/IL-6和IL-21诱导的STAT3磷酸化及靶基因表达；Act1−/−Il23r−/−和Act1−/−Il21r−/−小鼠及抗IL-21治疗减轻自身抗体、IgG沉积和炎症；回补WT-Act1而非Δ300–309突变体可纠正过度活化表型。
- 研究意义
- 提出Act1是IL-23依赖Th17反应和IL-21驱动B细胞功能中STAT3激活的免疫稳态检查点，为SNP-D10N突变与SLE易感性的关联提供机制解释，并提示IL-21阻断抗体可能用于治疗携带Act1突变的SLE样和Sjögren样综合征患者。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
Act1缺陷对Th17极化和STAT3激活的影响
明确Act1及IL-17受体家族成员缺陷对Th17极化和IL-23/IL-6诱导STAT3激活的作用
分选WT、Act1−/−、Il17ra−/−、Il17rc−/−、Il17rb−/−小鼠脾脏naive T细胞，IL-23+IL-6极化3天后胞内染色IL-17A和IFNγ；western检测p-STAT3及p-STAT4、p-STAT5；RT-PCR检测STAT3靶基因；免疫沉淀检测STAT3与IL-23R、IL-6R的结合
回补Act1及突变体纠正Th17过度活化
验证Act1的300–309区域及其STAT3结合能力对Th17极化的必要性
将WT-Act1或Act1Δ300–309突变体经逆转录病毒载体（携带RFP）导入Act1−/− naive T细胞，分选RFP+细胞在IL-6+IL-23条件下极化Th17，检测CD4+比例、western和IL-21基因表达
IL-23R和IL-21R在Act1缺陷自身免疫中的作用
检验IL-23R与IL-21R信号是否为Act1缺陷小鼠自身免疫所必需
构建Act1−/−Il23r−/−和Act1−/−Il21r−/−小鼠，检测8月龄小鼠血清抗组蛋白、抗dsDNA、抗ssDNA IgG，肾脏和颌下腺IgG免疫复合物沉积、H&E炎症、Th17标志mRNA及CD4+ T细胞和B220+ B细胞浸润
Th17来源IL-21促进B细胞扩增与抗体产生
验证Act1缺陷Th17细胞通过IL-21促进T–B细胞相互作用
流式检测Act1−/−小鼠脾脏IL-21+细胞来源及Tfh17标志；将WT或Act1−/− Th17细胞与CFSE标记B细胞共培养检测增殖，与WT、Act1−/−、Act1−/−Il21r−/− B细胞共培养10天ELISA检测免疫球蛋白；检测B细胞中IL-21诱导的STAT3磷酸化及STAT3与IL-21R结合
抗IL-21体内治疗Act1缺陷小鼠
评估IL-21中和抗体对已建立自身免疫疾病的治疗作用
4月龄SPF Balb/c Act1−/−小鼠腹腔注射抗IL-21中和抗体或IgG对照3个月，每月采集血清检测自身抗体和免疫球蛋白亚型，检测肾脏和颌下腺IgG沉积、细胞浸润和H&E病理
人ACT1-D10N突变与STAT3磷酸化
将小鼠机制外推至携带Act1-D10N突变的人细胞
转染ACT1各变异体后进行共免疫沉淀和western；检测ACT1WT/WT与ACT1D10N/D10N人CD4+ T细胞IL-6+IL-23诱导的p-STAT3及B细胞IL-21诱导的p-STAT3；RT-PCR检测ACT1变异体及Il17a、Il22、Il21、Ifnβ表达
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养与刺激 | 重组小鼠IL-6蛋白 | R&D | 406-ML-005 |
| 重组小鼠IL-23蛋白 | R&D | 1887-ML-010 | |
| 流式分析 | 羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯 | Molecular Probes | C34554 |
| 细胞刺激 | 佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯 | Sigma | -- |
| 离子霉素 | Sigma | -- | |
| 流式分析 | 蛋白转运抑制剂 | BD Biosciences | -- |
| 固定/透化试剂盒 | BD | -- | |
| RNA提取与RT-qPCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| Superscript II逆转录酶 | Invitrogen | -- | |
| SYBR Green试剂 | Invitrogen | -- | |
| 组织匀浆 | OMNI TH组织匀浆器 | Omni International | -- |
| 免疫荧光染色 | 马抗小鼠IgG（H+L） | Vector laboratories, Inc. | TI-2000 |
| 流式分析 | 大鼠抗小鼠CD4抗体 | eBioscience | RM4–5 |
| 大鼠抗小鼠CD44抗体 | eBioscience | IM7 | |
| 大鼠抗小鼠IFNγ抗体 | eBioscience | XMG1.2 | |
| 大鼠抗小鼠CD8抗体 | eBioscience | 53–6.7 | |
| 大鼠抗小鼠IgM抗体 | eBioscience | 11/41 | |
| 大鼠抗小鼠IL-4抗体 | eBioscience | 11b11 | |
| 大鼠抗小鼠IL-21抗体 | eBioscience | mhalx21 | |
| 仓鼠抗小鼠PD1抗体 | eBioscience | J43 | |
| 大鼠抗小鼠IL17A抗体 | Biolegend | TC11-18H10 | |
| 大鼠抗小鼠Bcl6抗体 | Biolegend | 7D1 | |
| 小鼠抗小鼠Fas抗体 | Biolegend | SA367H8 | |
| 大鼠抗小鼠CD138抗体 | Biolegend | 281–2 | |
| 仓鼠抗小鼠CD3抗体 | Biolegend | 145–2c11 | |
| 大鼠抗小鼠B220抗体 | Biolegend | RA3–6B2 | |
| 大鼠抗小鼠CD45抗体 | Biolegend | 30–F11 | |
| 仓鼠抗小鼠ICOS抗体 | Biolegend | C398.4A | |
| 大鼠抗小鼠CXCR5抗体 | Biolegend | L138D7 | |
| 大鼠抗小鼠CD23抗体 | BD | B3B4 | |
| 大鼠抗小鼠CD21抗体 | BD | 7G6 | |
| 细胞培养 | 大鼠抗小鼠IL-4抗体 | BD | 554432 |
| 大鼠抗小鼠IFNγ抗体 | BD | 559065 | |
| T细胞活化 | 纯化NA/LE仓鼠抗小鼠CD3e抗体 | BD | 553057 |
| 纯化NA/LE仓鼠抗小鼠CD28抗体 | BD | 553294 | |
| Western blot | 兔抗小鼠/人STAT3抗体 | Cell Signaling Technology | 12640S |
| Stat抗体试剂盒II | Cell Signaling Technology | 93130 | |
| 兔抗小鼠p-STAT1（Tyr701）抗体 | Cell Signaling Technology | 9167S | |
| 兔抗小鼠p-STAT5（Tyr694）抗体 | Cell Signaling Technology | 4322T | |
| 兔抗小鼠p-STAT6（Tyr641）抗体 | Cell Signaling Technology | 56554S | |
| 兔抗小鼠/人磷酸化STAT3（Tyr705）抗体 | Cell Signaling Technology | 9131L | |
| 兔抗HA抗体 | Cell Signaling Technology | 3724S | |
| 兔抗Flag抗体 | Cell Signaling Technology | 2368s | |
| 小鼠抗HA抗体 | Sigma | HA-7 | |
| 小鼠抗M2抗体 | Sigma | M2 | |
| 流式分析 | 大鼠抗小鼠GL7抗体 | Thermo Fisher | 13-5902-81 |
| 免疫荧光染色 | 山羊抗花生凝集素 | Vector lab | AS2074 |
| Western blot | 兔抗小鼠IL-12Rb1抗体 | Abcam | 97813 |
| 兔抗小鼠p-STAT2（Y690）抗体 | Abcam | 53132 | |
| 兔抗小鼠p-STAT4（Y693）抗体 | Abcam | 28815 | |
| 山羊抗小鼠/人β-Actin抗体 | Santa Cruze | C-2 | |
| 蛋白相互作用检测 | Duolink原位荧光试剂盒 | Sigma | -- |
| 逆转录病毒制备 | Phoenix细胞 | ATCC | CRL-3213 |
| Western blot与免疫沉淀 | HeLa细胞系 | ATCC | CCL-2 |
| 基因敲低 | shRNA质粒 | Sigma | TRCN0000105990 |
| shRNA质粒 | Sigma | TRCN0000105992 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠模型与取材年龄 | 小鼠品系背景、性别、饲养条件与取材月龄：C57BL/6背景雌性，SPF，8月龄；Balb/c Act1−/−用于抗IL-21治疗时为4月龄起 阅读提示：Methods的Mice小节及图3、图5、图7图注 |
| Th17体外极化 | naive T细胞分选标记（CD3+CD4+CD44low）；抗CD3 1 μg/ml、抗CD28 2 μg/ml；IL-6 10 ng/ml、IL-23 10 ng/ml；抗IFNγ 10 μg/ml、抗IL-4 10 μg/ml；极化3天 阅读提示：Methods的In vitro T cell polarization小节及图1c、图2图注 |
| T–B细胞共培养与增殖 | MOG35–55浓度在方法中记为2 ng/ml、图注中记为2 μg/ml，存在差异；抗IL-21中和抗体10 μg/ml；CFSE 2.5 μM；共培养3天检测增殖，10天检测抗体 阅读提示：Methods的B cell differentiation与Th17 induced antibody production小节，以及图6b、c图注，需核对MOG35–55浓度差异 |
| 抗IL-21体内治疗 | 抗体剂量0.5 mg/只、隔日腹腔注射、持续3个月；对照为IgG；Balb/c Act1−/−小鼠4月龄起治疗 阅读提示：Methods的Anti-IL21 antibody treatment in vivo小节及图7图注 |
| 统计学设计 | 每组样本量N=3–7（不同实验不同）；mean±SEM；双尾Student’s t检验；至少两次独立实验 阅读提示：Methods的Statistical analysis小节及各图注 |