构建Ccp1/Ccp6缺陷MEF并进行iPSC诱导
验证CCP1或CCP6缺陷是否影响体细胞重编程效率
从Ccp1−/−、Ccp6−/−及WT E14.5胚胎分离MEFs，转导OSKM或STEMCCA，在ESC培养基中培养3周，进行AP染色和Nanog染色计数集落，并检测SSEA-1和多能基因表达。
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Klf4的谷氨酰化是细胞重编程和小鼠早期胚胎发育所必需的
Klf4 glutamylation is required for cell reprogramming and early embryonic development in mice.
实验完整度
高包含MEF/iPSC/ESC体外模型、敲除敲入小鼠体内模型，并通过多聚谷氨酰化、泛素化、稳定性及胚胎发育进行功能与机制验证
主要模型
Ccp1−/−或Ccp6−/−小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)诱导的iPSC 小鼠胚胎干细胞D3和R1 人胚胎干细胞H9和人iPSC Ccp6−/−、Ttll1−/−、Ttll4−/−及Klf4E381A敲入小鼠胚胎与MEF
重点核对
OSKM或STEMCCA诱导iPSC时，Ccp1−/−、Ccp6−/− MEFs的AP阳性或Nanog阳性集落数较WT增加 Klf4 Glu381为TTLL4/TTLL1介导多聚谷氨酰化的受体位点，Klf4-E381A突变消除谷氨酰化信号 TTLL4介导的Klf4谷氨酰化竞争性抑制其与βTrCP1结合，减少K48连接泛素化并维持Klf4稳定性 Ttll1−/−、Ttll4−/−及Klf4E381A敲入小鼠显示囊胚发育受损、胚胎致死或出生率显著降低 Klf4-E381A恢复降低AP阳性集落和多能基因表达，而Klf4-K232R恢复显示相反结果
摘要
多能性网络的时间和空间特异性调控在很大程度上依赖于核心转录因子的精确修饰。谷氨酰化调控异常与严重的生理异常相关。然而，谷氨酰化如何调控细胞重编程和多能性网络仍不清楚。本文中我们展示，胞质羧肽酶1 (CCP1) 或 CCP6 缺陷显著促进诱导多能干细胞 (iPSC) 诱导和胚胎干细胞 (ESC) 的多能性。在细胞重编程过程中，微管蛋白酪氨酸连接酶样4 (TTLL4) 和 TTLL1 在 Klf4 的 Glu381 位点进行多聚谷氨酰化，阻碍其赖氨酸48连接的泛素化并维持 Klf4 稳定性。Klf4-E381A 敲入小鼠显示囊胚发育受损和胚胎致死。TTLL4 或 TTLL1 的缺失消除细胞重编程和早期胚胎发生。因此，Klf4 多聚谷氨酰化在细胞重编程调控和多能性维持中发挥关键作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 谷氨酰化修饰如何调控细胞重编程、多能性维持及早期胚胎发育尚不清楚，本研究旨在阐明其分子机制。
- 核心机制
- TTLL4或TTLL1在Klf4的Glu381位点催化多聚谷氨酰化，阻碍其K48连接的泛素化，从而维持Klf4蛋白稳定性；CCP1或CCP6可水解该修饰。
- 主要证据
- 在Ccp1−/−、Ccp6−/−、Ttll1−/−、Ttll4−/− MEFs、ESCs、人ESCs/iPSCs及Klf4E381A敲入小鼠中，通过iPSC诱导、AP/Nanog染色、免疫印迹、免疫沉淀、体外谷氨酰化/泛素化重构、EMSA及胚胎发育分析验证。
- 研究意义
- 研究揭示Klf4多聚谷氨酰化在细胞重编程和多能性维持中的关键作用，为通过操控谷氨酰化改善iPSC效率提供了机制依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测Ccp6缺陷及谷氨酰化调节剂对早期胚胎发育的影响
验证谷氨酰化调控是否影响受精后早期胚胎发育
从Ccp6+/+和Ccp6−/−或C57BL6/J小鼠分离2细胞期胚胎，在KSOM培养基中体外培养至E3.5，统计胚胎阶段分布；并分别用CoCl2或phenanthroline处理胚胎。
验证CCP1/CCP6对ESC多能性维持及人ES/iPSC的作用
验证谷氨酰化去修饰酶对小鼠和人多能干细胞自我更新和多能性的调控
在小鼠ESC D3、R1及人ESC H9、人iPSC中敲低或过表达CCP1/CCP6，培养后AP染色统计集落，qPCR检测多能基因；并将人iPSC皮下注射NOD/SCID小鼠检测畸胎瘤形成。
鉴定Klf4为CCP6/CCP1的谷氨酰化底物及修饰位点
确定重编程过程中受谷氨酰化调控的关键底物及其谷氨酰化受体位点
用CCP6mut固定化Affi-gel10树脂对OSKM诱导的MEF裂解物进行亲和层析，银染后质谱鉴定差异条带；用抗Klf4抗体免疫沉淀结合GT335/B3免疫印迹检测Klf4谷氨酰化；构建Klf4各谷氨酸富集区突变体进行体外谷氨酰化实验。
解析Klf4谷氨酰化对泛素化及蛋白稳定性的调控
验证Klf4多聚谷氨酰化是否通过阻碍K48连接泛素化维持其稳定性
在Ccp1−/−、Ccp6−/−、Ttll4−/− MEFs中检测CHX处理后Klf4降解和MG132处理后Klf4泛素化；用Ub(K48R)、Ub(K63R)确定泛素链类型；进行体外泛素化重构实验检测TTLL4介导谷氨酰化对βTrCP1/Skp1/Cullin1/Rbx1 E3连接酶泛素化的影响。
利用Klf4E381A敲入及TTLL1/TTLL4敲除小鼠进行体内验证
在体内验证Klf4 Glu381谷氨酰化及TTLL1/TTLL4对重编程和早期胚胎发育的必要性
通过CRISPR/Cas9构建Klf4E381A敲入、Ttll1−/−和Ttll4−/−小鼠；分离MEFs进行OSKM诱导iPSC；分离受精卵体外培养至E3.5统计发育阶段；免疫染色检测细胞命运标志物和凋亡；统计出生后代基因型比例。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| Western blot | 抗Myc标签抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-40 |
| 抗TTLL1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-86929 | |
| 抗CCP6抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-138893 | |
| 流式细胞术 | 抗SSEA-1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-21702 |
| Western blot | 抗GST标签抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-138 |
| 抗Flag标签抗体 | Sigma-Aldrich | F3165 | |
| 抗β-actin抗体 | Sigma-Aldrich | A-5316 | |
| 抗His标签抗体 | Sigma-Aldrich | H1029 | |
| 抗谷氨酰化微管蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | B3 | |
| 抗GFP标签抗体 | Sigma-Aldrich | G-1544 | |
| 免疫荧光/Western blot | GT335抗体 | AdipoGen | -- |
| Western blot | 抗TTLL4抗体 | Abnova | PAB22002 |
| 抗K48连接泛素抗体 | Abcam | ab140601 | |
| 免疫荧光 | 抗Gata6抗体 | Abcam | ab22600 |
| Western blot | 抗Klf4抗体 | ProteinTech | 11880-1-AP |
| 抗CCP1抗体 | ProteinTech | 14067-1-AP | |
| 免疫荧光 | 抗Nanog抗体 | ProteinTech | 14295-1-AP |
| 抗微管蛋白抗体 | Beyotime | AT819 | |
| 抗CDX2抗体 | BioGenex | CDX2-88 | |
| 免疫荧光/流式 | 抗cleaved caspase 3抗体 | Cell Signaling Technology | #9661 |
| 免疫荧光 | Alexa-405/488/594/649标记二抗 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 药物处理 | MG132 | Sigma-Aldrich | -- |
| 菲咯啉 | Sigma-Aldrich | -- | |
| MLN4924 | Sigma-Aldrich | -- | |
| DNase I可及性实验 | DNase I | Roche Molecular Biochemicals | -- |
| 免疫荧光 | DAPI | Sigma-Aldrich | -- |
| 质谱 | LTQ Orbitrap XL质谱仪 | Thermo Finnigan | -- |
| 胚胎培养 | KSOM培养基 | Millipore | -- |
| 胚胎收集 | M2培养基 | Millipore | -- |
| 体外泛素化重构 | 重组活性ERK1 | Millipore | -- |
| EMSA | LightShift化学发光EMSA试剂盒 | Thermo Scientific | -- |
| RNA提取 | RNA微量制备试剂盒 | LCsciences | -- |
| cDNA合成 | M-MLV逆转录酶 | Promega | -- |
| qPCR | ABI 7300 qPCR仪 | -- | -- |
| 亲和层析 | 直链淀粉树脂 | New England BioLabs | -- |
| 蛋白纯化 | 谷胱甘肽Sepharose 4B珠 | -- | -- |
| Ni-NTA树脂柱 | Novagen | -- | |
| 转染 | 脂质体转染试剂 | Invitrogen | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| iPSC诱导 | MEF来源（E14.5胚胎）、基因型（Ccp1−/−、Ccp6−/−、Ttll4−/−或4F2A）、OSKM/STEMCCA转导方式、dox浓度、培养3周、AP或Nanog染色计数、n=4-5 阅读提示：Methods中iPSC generation小节及Fig. 1b、Fig. 5a、Fig. 7a图注 |
| 早期胚胎体外培养 | 胚胎分离阶段（E1.5或受精卵）、KSOM+1 mg/ml BSA、37 °C 5% CO2、CoCl2 10 μM或phenanthroline 1 μM处理、E3.5统计、每组>100枚胚胎 阅读提示：Methods中Embryo collection and culture小节及Fig. 1f-g、Fig. 8b图注 |
| Klf4谷氨酰化位点鉴定 | Klf4四个谷氨酸富集区突变体（E46A、E97A、E329A、E384A）构建、TTLL4/CCP1/CCP6过表达293T裂解物与GST-Klf4 37 °C孵育2 h、GST pulldown后免疫印迹 阅读提示：Methods中In vitro glutamylation assay小节及Fig. 3e、Supplementary Figure 4d |
| Klf4泛素化与稳定性检测 | CHX 20 μg/ml处理时间点、MG132 10 μM或20 μM处理4 h、抗Klf4免疫沉淀后抗泛素免疫印迹、Ub(K48R)/Ub(K63R)转染、体外泛素化重构各组分与30 °C 2 h条件 阅读提示：Methods中Immunoprecipitation assay和In vitro ubiquitination reconstitution assay小节及Fig. 4a-c、Fig. 4e图注 |
| Klf4E381A敲入及Ttll1/Ttll4敲除小鼠制备 | CRISPR/Cas9 sgRNA序列、Cas9 mRNA 100 ng/μl和sgRNA 50 ng/μl显微注射、Klf4E381A模板序列、F0/F1基因型鉴定、杂合互交后出生幼鼠基因型统计 阅读提示：Methods中Generation of knockout and Klf4E381A knockin mice小节及Fig. 6e、Fig. 8c |