TRIM11对错误折叠蛋白降解的影响
验证TRIM11是否促进错误折叠蛋白的清除。
在HCT116、MCF7和U2OS细胞中过表达或敲低TRIM11，热休克处理，检测K48多聚泛素化蛋白、aggresome、淀粉样纤维和YFP-CL1降解。
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TRIM11通过调控USP14激活蛋白酶体并促进整体蛋白降解
TRIM11 activates the proteasome and promotes overall protein degradation by regulating USP14.
实验完整度
高包含细胞模型、基因敲除/敲低、蛋白互作、体外生化、小鼠移植瘤和临床组织验证。
主要模型
人结肠癌HCT116细胞 人乳腺癌MCF7细胞 人骨肉瘤U2OS细胞 Usp14敲除或Atg5敲除小鼠胚胎成纤维细胞 裸鼠皮下移植瘤模型 结肠癌临床组织芯片
重点核对
TRIM11过表达和敲低对K48多聚泛素化蛋白、aggresome和淀粉样纤维的影响 TRIM11与USP14及蛋白酶体亚基PSMD2的共免疫沉淀和体外pull-down TRIM11对USP14去泛素化酶活性和蛋白酶体肽酶活性的影响 USP14敲低或敲除对TRIM11效应的影响 TRIM11和USP14对裸鼠移植瘤生长的影响
摘要
蛋白酶体是负责蛋白质质量控制和细胞调节的复杂蛋白酶，其功能障碍与癌症和其他疾病相关。然而，正常和恶性细胞中控制蛋白酶体活性的机制尚不清楚。本文报道TRIM11增强异常和正常调节蛋白的降解，并提高整体蛋白水解速率。机制上，TRIM11同时结合蛋白酶体和USP14（一种去泛素化酶，可过早从蛋白酶体结合的底物上移除泛素，并以非催化方式抑制蛋白酶体），阻止二者结合，从而提高蛋白酶体活性。TRIM11促进细胞存活，并在热休克后上调。此外，TRIM11是肿瘤生长所必需的，TRIM11表达增加与临床生存期差相关。这些发现确定了TRIM11是蛋白酶体的重要激活因子，定义了一条调节蛋白酶体活性的通路，并揭示了肿瘤细胞获得更高降解能力以支持致癌生长的机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TRIM11是否以及如何调节蛋白酶体活性和整体蛋白降解，及其在肿瘤生长中的作用。
- 核心机制
- TRIM11通过与USP14的UBL结构域及蛋白酶体亚基PSMD2结合，阻止USP14招募到蛋白酶体，从而解除USP14对蛋白酶体的抑制并激活蛋白酶体。
- 主要证据
- 在HCT116等细胞中，TRIM11过表达增加蛋白酶体活性并加速YFP-CL1、p53、p21和Mdm2降解；TRIM11敲低则相反；USP14敲低或敲除减弱TRIM11效应；裸鼠移植瘤实验显示TRIM11促进肿瘤生长而USP14过表达抑制肿瘤生长。
- 研究意义
- 确定TRIM11为蛋白酶体重要激活因子，定义了一条调节蛋白酶体活性的通路，并揭示肿瘤细胞获得更高降解能力以支持致癌生长的机制。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
TRIM11对正常调节蛋白和整体蛋白降解的影响
验证TRIM11是否促进正常调节蛋白和整体蛋白降解。
在HCT116细胞中过表达或敲低TRIM11，CHX追踪检测p53、p21、Mdm2半衰期，并用3H-Phe脉冲追踪检测整体蛋白降解速率。
TRIM11对蛋白酶体活性的影响及依赖性
验证TRIM11是否通过蛋白酶体发挥作用并激活蛋白酶体。
在HCT116、MCF7、U2OS细胞中过表达或敲低TRIM11，用荧光底物检测蛋白酶体三种活性，并用BTZ、CFZ、CQ及Atg5 KO MEF验证依赖性。
TRIM11与蛋白酶体及USP14的相互作用
鉴定TRIM11的相互作用蛋白并验证其与蛋白酶体和USP14的结合。
Flag-TRIM11和Flag-USP14免疫沉淀结合质谱鉴定互作蛋白，co-IP和体外pull-down验证TRIM11与PSMD2、USP14的相互作用。
TRIM11阻止USP14招募到蛋白酶体
验证TRIM11是否干扰USP14与PSMD2的结合及USP14的蛋白酶体招募。
在过表达或敲低TRIM11的HCT116细胞中，用co-IP检测USP14与PSMD2结合，用原生胶电泳检测USP14与26S/30S蛋白酶体的结合。
TRIM11抑制USP14去泛素化酶活性并解除其对蛋白酶体的抑制
验证TRIM11是否抑制USP14活性并因此激活蛋白酶体。
用Ub-AMC检测蛋白酶体富集裂解液或重组USP14的去泛素化酶活性，用Suc-LLVY-AM检测蛋白酶体活性，并用USP14敲低或敲除细胞验证TRIM11效应的依赖性。
TRIM11-USP14相互作用的结构决定因素
确定介导TRIM11与USP14相互作用的结构域。
构建USP14的UBL和USP结构域GST融合蛋白及TRIM11缺失突变体，用pull-down和co-IP检测相互作用，并检测TRIM11-2CA突变体对USP14招募和蛋白酶体活性的影响。
TRIM11对细胞存活和增殖的影响及USP14的拮抗
验证TRIM11-USP14轴对细胞存活和凋亡的影响。
在热休克和恢复条件下检测TRIM11表达、caspase-3激活和凋亡，过表达或敲低TRIM11和USP14，检测细胞形态、增殖和凋亡。
TRIM11和USP14在肿瘤生长中的作用
验证TRIM11和USP14对体内肿瘤生长的影响及TRIM11的临床相关性。
将稳定敲低或过表达TRIM11、过表达USP14的HCT116细胞皮下注射裸鼠，监测肿瘤体积；用IHC检测结肠癌组织TRIM11表达并分析生存数据。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养与处理 | 硼替佐米 | LC Laboratories | B-1408 |
| 卡非佐米 | BioVision | -- | |
| MG132 | Sigma | -- | |
| 氯喹 | Sigma | -- | |
| IU1 | Calbiochem | -- | |
| 聚凝胺 | -- | -- | |
| 重组人USP14 | Enzo Life Sciences | BML-UW9840 | |
| Western blot | 抗微管蛋白抗体 | Sigma | T6074 |
| 抗Flag M2抗体 | Sigma | F3165 | |
| 抗HA抗体 | Thermo Fisher Scientific | 71-5500 | |
| 抗GFP抗体 | MBL | M048-3 | |
| 抗GAPDH抗体 | Novus Biologicals | NB300-221 | |
| 抗TRIM11抗体 | EMD Millipore | ABC926 | |
| 抗20S蛋白酶体α/β亚基抗体 | Enzo Life Sciences | BML-PW8155 | |
| 抗20S蛋白酶体α1–7抗体 | Enzo Life Sciences | BML-PW8195 | |
| 抗p53抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-126 | |
| 抗p21抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-6246 | |
| 抗Mdm2抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-965 | |
| 抗泛素抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-8017 | |
| 抗USP14抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-100630 | |
| 抗HSF1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-9144 | |
| 抗caspase-3抗体 | Cell Signaling Technology | 9662 | |
| 抗切割caspase-3抗体 | Cell Signaling Technology | 9661 | |
| 抗ATG5抗体 | Cell Signaling Technology | 2630 | |
| 抗K48连接多聚泛素链抗体 | Cell Signaling Technology | 4289 | |
| 抗USP14抗体 | Bethyl Laboratories | A300-919A | |
| 抗TRIM28抗体 | Bethyl Laboratories | A300-275A | |
| 抗PSMD1抗体 | Bethyl Laboratories | A303-851A | |
| 抗PSMD2抗体 | Bethyl Laboratories | A303-853A | |
| 抗PSMD11抗体 | Bethyl Laboratories | A302-750A | |
| 免疫沉淀 | Flag M2磁珠 | Sigma | -- |
| HA琼脂糖 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Protein A/G琼脂糖 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 蛋白纯化 | GST-Sepharose 4B beads | GE Healthcare Life Sciences | -- |
| 3× Flag肽 | Sigma | -- | |
| 谷胱甘肽 | Sigma | -- | |
| 蛋白酶体活性检测 | Suc-LLVY-AMC | Enzo | -- |
| Ac-nLPnLD-AMC | Enzo | -- | |
| Ac-RLR-AMC | Enzo | -- | |
| 去泛素化酶活性检测 | Ub-AMC | Boston Biochem | -- |
| 19S蛋白酶体 | Boston Biochem | -- | |
| 检测aggresome和淀粉样纤维 | ProteoStat aggresome染料 | Enzo Life Sciences | -- |
| 硫黄素T | Sigma | -- | |
| 凋亡分析 | FITC凋亡检测试剂盒I | BD Biosciences | -- |
| 细胞活力检测 | MTT | Promega | -- |
| qPCR | SYBR Green PCR预混液 | -- | -- |
| 7900HT快速实时PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| 第一链cDNA合成试剂盒 | Marligen Biosciences | -- | |
| RNA提取 | TRIzol | Invitrogen | -- |
| 蛋白定量 | Bradford实验 | Bio-Rad Labs | -- |
| 蛋白酶体纯化 | 快速26S蛋白酶体纯化试剂盒 | Ubiquitin-Proteasome Biotechnologies | -- |
| 流式分析 | BD Accuri C6流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| 荧光检测 | Infinite M200微孔板荧光仪 | Tecan | -- |
| 质谱 | Q-Exactive质谱仪 | Thermo Scientific | -- |
| EasyLC系统 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 热休克处理 | HCT116和MEF细胞43°C 90 min，MCF7和U2OS细胞45°C；恢复条件37°C 60或120 min 阅读提示：Methods中Cell culture and stable cell lines；Fig. 1a和Fig. 7a图注 |
| CHX追踪实验 | CHX浓度50 μg/ml；处理时间点 阅读提示：Methods中Immunoblotting and immunoprecipitation；Fig. 1i和Fig. 2a图注 |
| 整体蛋白降解检测 | 3H-Phe 5 μCi/ml标记24 h；非放射性Phe 2 mM chase；BTZ 0.5 μM或CQ 50 μM 阅读提示：Methods中Overall protein degradation；Fig. 2d和Fig. 3a图注 |
| 蛋白酶体活性检测 | 荧光底物Suc-LLVY-AMC、Ac-nLPnLD-AMC、Ac-RLR-AMC；BTZ 0.2 μM和CFZ 0.5 μM；蛋白量4–8 μg 阅读提示：Methods中Proteasome activity assay；Fig. 3c和Supplementary Fig. 3 |
| USP14去泛素化酶活性检测 | Ub-VS预处理19S蛋白酶体5 nM；重组蛋白50 nM；IU1 100 μM 阅读提示：Methods中Ub-AMC hydrolysis activity of USP14；Fig. 5a和5b图注 |
| 裸鼠移植瘤实验 | 细胞数1×10^6；4–6周龄athymic Balb-c nu/nu雄性小鼠；n=4；16天后处死；肿瘤体积公式π/6×(width)^2×length 阅读提示：Methods中Tumor xenografts；Fig. 8a和8b图注 |
| 临床组织芯片分析 | 结肠癌组织芯片CO953；TRIM11低表达n=28，高表达n=32；生存分析log-rank检验 阅读提示：Methods中Immunofluorescence and immunohistochemistry；Fig. 8c–e图注 |