验证SOX10对FOXD3诱导的必要性和充分性
确定SOX10是否介导ERK抑制引起的FOXD3表达。
在突变BRAF黑色素瘤细胞中用siRNA敲低SOX10，再用Vemurafenib处理，检测FOXD3的mRNA和蛋白水平；并进行siRNA抗性HA-SOX10回补实验。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
ERK介导的磷酸化调控突变BRAF黑色素瘤中SOX10的SUMO化及靶基因表达
ERK-mediated phosphorylation regulates SOX10 sumoylation and targets expression in mutant BRAF melanoma.
实验完整度
高包含细胞系、生化实验、小鼠移植瘤模型及患者数据相关性分析，并有功能与机制验证。
主要模型
突变BRAF黑色素瘤细胞系（1205Lu、A375、M238） HEK293T细胞 BALB/c裸鼠移植瘤模型 黑色素瘤患者数据集（TCGA RNA-seq和Talantov等芯片数据）
重点核对
SOX10敲低使用12.5 nM siRNA转染72小时，并以非靶向siRNA为对照 Vemurafenib处理浓度2 μM，时间点包括0、6、24小时等 四环素诱导的HA-SOX10回补实验使用100 ng/mL Doxycycline 动物实验每组N=7，Vemurafenib腹腔注射30 mg/kg每日，DMSO对照 双荧光素酶报告基因实验使用500 ng pGL3-FOXD3、50 ng pRL-TK和递增的SOX10质粒
摘要
在人类突变BRAF黑色素瘤细胞中，抑制ERK1/2信号可快速诱导干性转录因子FOXD3，并介导对RAF抑制剂的适应性耐药。然而，ERK信号调控FOXD3表达的机制尚不清楚。本研究表明，SOX10是突变BRAF黑色素瘤细胞中RAF抑制剂诱导FOXD3表达的必要且充分条件。SOX10通过结合FOXD3启动子中的调控元件激活FOXD3转录。ERK对SOX10的磷酸化通过干扰SOX10在K55位点的SUMO化（该修饰对其转录活性至关重要）抑制其对多个靶基因的转录活性。最后，敲低SOX10在体外和体内使突变BRAF黑色素瘤细胞对RAF抑制剂敏感。因此，本研究发现了SOX10转录活性的一种新的磷酸化依赖性调控机制，并完善了介导突变BRAF黑色素瘤细胞对RAF抑制剂适应性耐药的ERK1/2/SOX10/FOXD3/ERBB3轴。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 在突变BRAF黑色素瘤细胞中，ERK信号如何调控FOXD3的表达并介导对RAF抑制剂的适应性耐药。
- 核心机制
- ERK2磷酸化SOX10的T240和T244位点，抑制SOX10在K55位点的SUMO化，从而降低SOX10对FOXD3等靶基因的转录活性；SOX10通过结合FOXD3启动子调控其转录。
- 主要证据
- 通过siRNA敲低和回补实验证明SOX10对FOXD3诱导的必要性和充分性；双荧光素酶、ChIP和寡核苷酸pull-down证明SOX10直接结合FOXD3启动子；质谱和体外激酶实验鉴定ERK磷酸化位点；磷酸化模拟突变和SUMO化突变实验揭示磷酸化抑制SUMO化；小鼠移植瘤模型显示SOX10敲低增强Vemurafenib疗效。
- 研究意义
- 完善了ERK/SOX10/FOXD3/ERBB3轴介导的适应性耐药机制，揭示了磷酸化与SUMO化交互调控SOX10转录活性的新机制，为突变BRAF黑色素瘤的联合治疗策略提供理论依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证SOX10直接结合并激活FOXD3启动子
探究SOX10是否通过直接结合FOXD3启动子调控其转录。
构建FOXD3启动子 luciferase报告基因及突变体，进行双荧光素酶实验；用ChIP和寡核苷酸pull-down检测SOX10与FOXD3启动子位点3的结合。
鉴定ERK对SOX10的磷酸化位点
确定ERK是否直接磷酸化SOX10及其具体位点。
通过MRM质谱检测细胞内SOX10 T240/T244磷酸化；体外激酶实验用重组ERK2和合成SOX10肽段；用磷酸化特异性抗体检测突变体磷酸化。
验证磷酸化对SOX10转录活性的影响
探究T240/T244磷酸化是否调控SOX10对靶基因的转录活性。
构建磷酸化模拟突变体T240E、T244E、EE，在敲低内源SOX10的细胞中回补，检测FOXD3、MITF、TYR、SAMMSON表达；双荧光素酶实验检测启动子活性。
验证SOX10的SUMO化位点及其功能
确定SOX10的SUMO化位点及其对转录活性的重要性。
共表达Flag-SUMO1和HA-SOX10突变体（K55R、K357R、2KR），检测SUMO化；在敲低内源SOX10的细胞中回补SUMO化突变体，检测FOXD3诱导；双荧光素酶实验检测启动子活性。
探究磷酸化与SUMO化的相互作用
验证磷酸化是否抑制SOX10的SUMO化及其机制。
比较野生型与磷酸化模拟突变体的SUMO化水平；检测SOX10与UBC9的相互作用；GST pull-down验证；双荧光素酶实验检测SUMO1融合突变体活性。
评估SOX10敲低对RAF抑制剂敏感性的影响
验证SOX10敲低是否通过阻断FOXD3/ERBB3/AKT轴使黑色素瘤细胞对RAF抑制剂敏感。
在体外用siRNA敲低SOX10，检测ERBB3/AKT信号和凋亡；在体内用shRNA敲低SOX10的细胞建立小鼠移植瘤模型，给予Vemurafenib治疗，监测肿瘤生长。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | 维莫非尼 | Selleck Chemicals LLC | -- |
| SCH772984 | Selleck Chemicals LLC | -- | |
| AZD6244 | Selleck Chemicals LLC | -- | |
| 细胞培养 | 多西环素 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 细胞刺激 | 人神经调节蛋白-1 | Cell Signaling Technology | 5218 |
| Western blot | 磷酸化p44/42 MAPK抗体 | Cell Signaling Technology | 4377 |
| FOXD3抗体 | Cell Signaling Technology | 2019 | |
| HA标签抗体 | Cell Signaling Technology | 2367; 3724 | |
| Myc标签抗体 | Cell Signaling Technology | 2278 | |
| HER3/ErbB3抗体 | Cell Signaling Technology | 4754 | |
| 磷酸化Akt抗体 | Cell Signaling Technology | 4060 | |
| Akt抗体 | Cell Signaling Technology | 9272 | |
| 磷酸化MAPK底物基序抗体 | Cell Signaling Technology | 14378 | |
| β-肌动蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | A2066 | |
| FLAG标签抗体 | Sigma-Aldrich | F3165 | |
| SOX10抗体 | Santa Cruz Biotechnology | SC-17342 | |
| FOXD3抗体 | Biolegend | 631702 | |
| RNA提取 | TriPure分离试剂 | Roche | -- |
| RT-PCR | iScript cDNA合成试剂盒 | BioRad | -- |
| qPCR | iQ SYBR Green Supermix | BioRad | -- |
| CFX Connect实时PCR检测系统 | BioRad | -- | |
| 双荧光素酶实验 | X-tremeGENE HP DNA转染试剂 | Roche | -- |
| 双荧光素酶报告基因检测试剂盒 | Promega | -- | |
| FlexStations 3酶标仪 | Molecular Devices | -- | |
| ChIP | protein A/G Plus琼脂糖珠 | Santa Cruz | -- |
| 寡核苷酸pull-down | 链霉亲和素琼脂糖珠 | NEB | -- |
| 体外激酶实验 | CSBio 336X自动肽合成仪 | CSBio | -- |
| 重组ERK2 | NEB | -- | |
| 1X NEBuffer | NEB | -- | |
| 免疫沉淀 | 抗HA磁珠 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 质谱 | AB SCIEX QTRAP 6500+质谱仪 | AB SCIEX | -- |
| Eksigent nanoflex cHiPLC系统 | Eksigent | -- | |
| 反相ChromXP C18-CL色谱柱 | -- | -- | |
| 质谱数据分析 | Skyline软件 | -- | -- |
| 载体构建 | pENTR/D-TOPO载体 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Quickchange定点突变试剂盒 | Agilent Technologies Inc. | -- | |
| 细胞凋亡检测 | Annexin-V-FLUOS试剂盒 | Roche | -- |
| 流式细胞术 | CytoFLEX流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- |
| 流式数据分析 | Flowjo软件 | Three Star, Inc. | -- |
| siRNA转染 | Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | -- |
| siRNA | SOX10 siRNA #1 | Shanghai GenePharma Co., Ltd. | -- |
| SOX10 siRNA #2 | Shanghai GenePharma Co., Ltd. | -- | |
| GST pull-down | 谷胱甘肽磁珠 | GeneScript | -- |
| 蛋白纯化 | Superdex 75色谱柱 | GE health care | -- |
| 免疫荧光 | 倒置显微镜系统 | Nikon | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| SOX10敲低及FOXD3诱导检测 | siRNA浓度12.5 nM，转染72小时；Vemurafenib 2 μM处理0、6、24小时；qRT-PCR以actin为内参；western blot验证蛋白水平。 阅读提示：Methods 'siRNA transfection'、'Quantitative RT-PCR'、'Western blotting'；Fig. 1a, b |
| SOX10回补实验 | Doxycycline 100 ng/mL诱导HA-SOX10表达；Vemurafenib 2 μM处理24小时；使用siRNA抗性HA-SOX10。 阅读提示：Methods 'Construction of lentiviral vectors and cell lines'；Fig. 1c |
| 双荧光素酶报告基因实验 | HEK293T细胞，500 ng pGL3-FOXD3（或突变体），50 ng pRL-TK，递增或500 ng SOX10质粒，转染48小时。 阅读提示：Methods 'Dual-luciferase assay'；Fig. 2a, c, Fig. 6e |
| ChIP实验 | A375-TR和1205Lu-TR细胞，Doxycycline 100 ng/mL处理72小时，Vemurafenib 2 μM处理6小时；使用HA抗体和IgG对照；qPCR检测FOXD3启动子位点3区域。 阅读提示：Methods 'Chromatin immunoprecipitation assay'；Fig. 2e |
| 体外激酶实验 | 0.5 mM SOX10肽段，200单位重组ERK2，0.5 mM ATP，30°C反应45分钟；LC-MS分析。 阅读提示：Methods 'In vitro kinase assay'；Fig. 3d |
| 体内SOX10磷酸化检测（MRM） | A375-TR HA-SOX10细胞，Doxycycline 100 ng/mL处理72小时，Vemurafenib 2 μM处理6小时；HA免疫沉淀后胰酶消化，MRM质谱检测。 阅读提示：Methods 'In vivo detection of SOX10 phosphorylation'；Fig. 3b, c |
| 小鼠移植瘤实验 | BALB/c裸鼠，5周龄雌性，每组N=7；细胞注射量2×10^6（1205Lu）或4×10^6（A375）；Doxycycline 2 mg/mL饮水；Vemurafenib 30 mg/kg腹腔注射每日；DMSO对照；肿瘤体积测量每2天。 阅读提示：Methods 'Animal studies'；Fig. 7c, d |
| 凋亡检测 | siRNA转染48小时，Vemurafenib 10 μM处理48小时（1205Lu）或72小时（A375）；Annexin-V/PI染色流式分析。 阅读提示：Methods 'Annexin V/PI apoptosis assay'；Fig. 7b |