建立耐药细胞模型
模拟临床获得性耐药，获取对gefitinib和osimertinib耐药的NSCLC细胞系。
将PC-9细胞暴露于递增浓度的gefitinib或osimertinib（起始10 nM），直至能在1 uM gefitinib或500 nM osimertinib中自由增殖，历时12周。同时使用H1975细胞作为gefitinib耐药模型。
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胆固醇通过诱导EGFR/Src/Erk/SP1信号介导的ERRα再表达促进NSCLC对EGFR-TKIs的耐药
Cholesterol promotes EGFR-TKIs resistance in NSCLC by inducing EGFR/Src/Erk/SP1 signaling-mediated ERRα re-expression
实验完整度
高包含细胞耐药模型、体外功能验证、分子机制研究（co-IP、CHIP等）、异种移植瘤模型及药物联合治疗验证，多层次证据支持结论。
主要模型
PC-9亲本细胞及吉非替尼耐药PC-9/GR细胞 PC-9奥希替尼耐药PC-9/OR细胞 H1975细胞（携带T790M突变） BALB/c裸鼠异种移植瘤模型
重点核对
耐药细胞系建立：PC-9/GR对gefitinib耐药，PC-9/OR对osimertinib耐药 胆固醇积累检测：Amplex Red Cholesterol Assay Kit和filipin染色确认脂筏胆固醇增加 EGFR/Src/Erk信号通路再激活：Western blot检测p-EGFR、p-Src、p-Erk水平 SP1核转位及ERRα转录调控：CHIP-qPCR验证SP1直接结合ERRα启动子 联合治疗：lovastatin或XCT790与EGFR-TKIs联用恢复敏感性
摘要
背景
表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKIs）的使用为携带EGFR突变的晚期NSCLC患者的生存带来了显著益处。不幸的是，获得性耐药似乎是不可避免的，并限制了EGFR-TKIs在临床实践中的应用。本研究报道了一种维持耐药的常见分子机制以及克服EGFR-TKIs耐药的潜在治疗选择。
方法
建立EGFR-TKIs耐药的NSCLC细胞，并通过MTT实验进行确认。检测胆固醇含量，并在体内确定胆固醇对NSCLC生长的促进作用。然后，我们确定ERRα表达是胆固醇介导的药物耐药的下游因子。为了解析调控机制，我们进行了包括免疫荧光、共免疫沉淀、荧光素酶报告基因和染色质免疫沉淀实验。
结果
长期暴露于EGFR-TKIs会产生耐药，其特征是脂筏中胆固醇积累，这促进EGFR和Src相互作用，导致EGFR/Src/Erk信号再激活介导的SP1核转位和ERRα再表达。进一步研究确定ERRα是SP1的靶基因。功能上，ERRα的再表达通过调节ROS解毒过程维持细胞增殖。洛伐他汀（一种降低胆固醇水平的药物）和XCT790（一种ERRα反向激动剂）在体外和体内均能克服吉非替尼和奥希替尼耐药。
结论
我们的研究表明，胆固醇/EGFR/Src/Erk/SP1轴诱导的ERRα再表达促进了吉非替尼和奥希替尼耐药癌细胞的存活。此外，我们证明了降低胆固醇和下调ERRα作为NSCLC有效辅助治疗的潜力。
补充信息
在线版本包含补充材料，可在10.1186/s12943-022-01547-3处获取。
关键词：非小细胞肺癌，EGFR-TKIs耐药，胆固醇
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 胆固醇积累如何促进NSCLC对EGFR-TKIs的耐药，以及其分子机制和潜在治疗策略。
- 核心机制
- EGFR-TKIs长期暴露导致脂筏胆固醇积累，促进EGFR与Src相互作用，激活EGFR/Src/Erk信号通路，使SP1核转位并直接结合ERRα启动子，诱导ERRα再表达，通过调节ROS解毒维持耐药细胞存活。
- 主要证据
- 体内外实验证明耐药细胞中胆固醇和ERRα水平升高；MβCD去胆固醇或抑制EGFR/Src/Erk信号降低ERRα表达；CHIP和荧光素酶实验证实SP1直接调控ERRα转录；lovastatin或XCT790联合EGFR-TKIs在细胞和移植瘤模型中恢复药物敏感性。
- 研究意义
- 揭示胆固醇/EGFR/Src/Erk/SP1/ERRα轴是EGFR-TKIs耐药的共同机制，为降低胆固醇或抑制ERRα作为NSCLC辅助治疗提供了依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证耐药性与胆固醇积累的关系
确认胆固醇积累是否与EGFR-TKIs耐药相关。
检测耐药细胞和异种移植瘤中总胆固醇、脂筏胆固醇和游离胆固醇水平，并进行细胞活力分析和体内肿瘤生长评估。
验证胆固醇介导ERRα表达
确定ERRα是否为胆固醇促进耐药的下游因子。
通过Western blot和RT-qPCR检测耐药细胞中ERRα表达，并用MβCD去除胆固醇或补充胆固醇观察ERRα变化。
验证ERRα功能及机制
评估ERRα对耐药细胞存活的影响，并探索其调控机制。
使用XCT790抑制ERRα，检测细胞活力、细胞周期和ROS水平；分析EGFR/Src/Erk信号通路对ERRα的调控；利用CHIP和荧光素酶实验验证SP1直接调控ERRα转录。
验证联合治疗策略
评估降低胆固醇或抑制ERRα能否恢复EGFR-TKIs敏感性。
在耐药细胞和异种移植瘤模型中，联合使用EGFR-TKIs与lovastatin或XCT790，检测细胞增殖、肿瘤生长及相关蛋白表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | KeyGen BioTech | KGM12800N-500 |
| 胎牛血清 | Wisent | 086150 | |
| 青霉素-链霉素 | Beyotime Biotechnology | ST488 | |
| Opti-MEM培养基 | Gibco | 51985-034 | |
| 细胞转染 | 脂质体2000 | Invitrogen | 11668-019 |
| EGFR小干扰RNA | HanBio | -- | |
| 质粒转染 | pCDNA3.1-SP1质粒 | Genomeditech | -- |
| 细胞活力检测 | MTT | Biofroxx | 3580GR001 |
| 胆固醇检测 | Amplex Red胆固醇检测试剂盒 | Invitrogen | A12216 |
| 菲律宾霉素 | Meilunbio | MB1848 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | KeyGen BioTech | KGP703-100 |
| 蛋白A+G琼脂糖 | Beyotime Biotechnology | P2055 | |
| EGFR抗体 | Cell Signaling Technology | 4267S | |
| SP1抗体 | Cell Signaling Technology | 9389S | |
| ERRα抗体 | Beyotime Biotechnology | -- | |
| CHIP | 染色质免疫沉淀试剂盒 | Beyotime Biotechnology | P2078 |
| 蛋白酶K | Beyotime Biotechnology | ST532 | |
| DNA纯化试剂盒 | Beyotime Biotechnology | D0033 | |
| RT-qPCR | Trizol试剂 | Vazyme | R401-01 |
| HiScript III逆转录预混液 | Vazyme | R323-01 | |
| ChamQ SYBR qPCR预混液 | Vazyme | Q341-02 | |
| 细胞周期检测 | PI/RNase染色缓冲液 | BD | 550825 |
| ROS检测 | DCFH-DA探针 | Beyotime Biotechnology | S0033S |
| 线粒体ROS检测 | MitoSOX红色线粒体超氧化物指示剂 | Yeasen | 40778ES50 |
| 免疫荧光 | DAPI | Beyotime Biotechnology | C1002 |
| CoraLite594偶联c-SRC抗体 | Proteintech | CL594-60315 | |
| 山羊抗兔IgG H&L (FITC) | Abcam | ab97050 | |
| 核蛋白提取 | 核浆蛋白提取试剂盒 | Beyotime Biotechnology | P0027 |
| 药物处理 | 吉非替尼 | Aladdin | -- |
| 洛伐他汀 | Aladdin | -- | |
| 奥希替尼 | Glpbio | -- | |
| XCT790 | MCE | -- | |
| 拉帕替尼 | Topscience | -- | |
| 甲羟戊酸 | Topscience | -- | |
| 胆固醇 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 甲基-β-环糊精 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 抑制剂处理 | WH-4-023 | MCE | -- |
| SCH772984 | AbMole | -- | |
| 普卡霉素 | MCE | -- | |
| 抑制实验 | 雷帕霉素 | AbMole | -- |
| AG-490 | Topscience | -- | |
| BAY 11-7082 | MCE | -- | |
| SIS3 | Selleck | -- | |
| Y27632 | AbMole | -- | |
| IHC | 一步法免疫组化试剂盒 | KeyGen BioTech | KGOS60 |
| 动物实验 | BALB/c裸鼠 | Yangzhou University | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 耐药细胞系建立 | PC-9细胞暴露于gefitinib或osimertinib的起始浓度、递增方案、最终维持浓度及处理时长。 阅读提示：Results部分'Generation of gefitinib-resistant and osimertinib-resistant NSCLC cells'及Figure 1a, b |
| 胆固醇检测 | 细胞和肿瘤组织中总胆固醇、脂筏胆固醇及游离胆固醇的检测方法、试剂盒及定量方式。 阅读提示：Methods部分'Isolation of lipid rafts'和'Amplex Red Cholesterol Assay Kit'，Result部分Figure 1e-g |
| 分子机制验证 | EGFR/Src/Erk信号通路抑制剂的种类、浓度及处理时间；SP1与ERRα启动子结合的验证方法（CHIP、荧光素酶报告基因）。 阅读提示：Methods部分'Co-immunoprecipitation'、'CHIP assay'、'Luciferase reporter assay'及Results部分Figures 4,5 |
| 体内异种移植瘤模型 | 细胞接种数量、小鼠周龄、分组、给药途径、剂量、频率及肿瘤体积测量时间点。 阅读提示：Methods部分'Tumor xenograft model'及Results部分Figure 1h-m和Figure 6d-j |
| 联合治疗评估 | 体外lovastatin或XCT790与EGFR-TKIs联用的浓度、处理时间及细胞活力检测方法；体内联合给药的剂量和途径。 阅读提示：Results部分'Combination of EGFR-TKIs with lovastatin or XCT790 overcome NSCLC resistance'及Figure 6 |