可成药基因组CRISPR筛选鉴定Keap1突变特异性依赖
在高通量水平发现Keap1突变细胞的特异性遗传依赖。
用靶向4,915个可成药基因的DGL文库感染两对KP和KPK等基因小鼠LUAD细胞系，比较t8与t0的sgRNA丰度，计算差异基因评分。
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Keap1突变使肺腺癌依赖Slc33a1
Keap1 mutation renders lung adenocarcinomas dependent on Slc33a1.
实验完整度
高体外等基因细胞系CRISPR筛选、人细胞系验证、移植瘤模型及GEMM体内验证，含功能与机制链路验证。
主要模型
小鼠KrasG12D/+; p53−/−（KP）与KrasG12D/+; p53−/−; Keap1−/−（KPK）等基因LUAD细胞系 人KEAP1突变LUAD细胞系（如A549）及KEAP1野生型细胞系（H2009、H441） KPC与KPKC基因工程小鼠LUAD模型（KrasLSL-G12D/+; p53fl/fl; Keap1fl/fl; R26LSL-Cas9/+） 免疫缺陷小鼠皮下移植瘤模型
重点核对
CRISPR筛选：DGL文库靶向4,915基因，MOI 0.3，感染后8次群体倍增，基因评分以t8 vs t0 sgRNA丰度log2倍数变化中位数计算 荧光竞争实验：pUSEPR或pUSPmNG标记sgRNA，第2天归一化，n=3技术重复 BSO处理浓度50 µM，Erastin 500 nM，Auranofin 500 nM，NAC 1 mM，DMG 2.5 mM GEMM实验：pUSEC慢病毒气管内感染20,000 TU，20周后分析组织学分级和肿瘤负荷 移植瘤实验：每侧注射1E6（sgRNA）或500E5（shRNA）细胞，100 µL PBS:Matrigel（50:50）或PBS
摘要
大约20-30%的人肺腺癌（LUAD）存在Kelch样ECH相关蛋白1（KEAP1）的功能丧失（LOF）突变，这些突变导致核因子E2相关因子2（NRF2）抗氧化途径过度激活，并与不良预后相关。我们先前表明，Keap1突变加速KRAS驱动的LUAD，并产生对谷氨酰胺分解的显著依赖。为了扩展对Keap1突变背景下遗传依赖性的研究，我们在Keap1突变细胞中进行了可成药基因组CRISPR-Cas9筛选。该分析揭示了Keap1突变体对溶质载体家族33成员1（Slc33a1）的显著特异性依赖，Slc33a1是一种与内膜相关的蛋白，参与自噬调节，以及一系列与未折叠蛋白反应相关的功能相关基因。使用小鼠和人Keap1突变肿瘤细胞系以及LUAD的临床前基因工程小鼠模型（GEMMs）进行的靶向遗传和生化实验，验证了Slc33a1作为稳健的Keap1突变特异性依赖。此外，无偏全基因组CRISPR筛选鉴定了与Slc33a1依赖性相关的额外基因。总体而言，我们的研究为携带KEAP1突变或NRF2过度激活肿瘤的患者分层为可能对靶向SLC33A1抑制有应答者提供了强有力的理由，并强调了将功能遗传方法与GEMMs相结合以识别和验证基因型特异性治疗靶点的价值。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Keap1突变肺腺癌是否存在除谷氨酰胺分解外的可靶向遗传依赖性，以及该依赖性是否由NRF2过度激活介导。
- 核心机制
- Keap1突变导致NRF2抗氧化途径过度激活和GSH合成增加，使细胞对内质网驻留蛋白Slc33a1缺失敏感；Slc33a1丢失诱导未折叠蛋白反应和代谢重编程，抑制GSH合成可 rescue 该缺陷。
- 主要证据
- 可成药基因组CRISPR筛选发现Slc33a1为Keap1突变特异性依赖；小鼠KPK细胞、人KEAP1突变细胞系及移植瘤中sgSlc33a1或shSlc33a1抑制生长；GEMM中sgSlc33a1降低KPKC肿瘤负荷和高级别腺癌比例；BSO rescue 生长缺陷并降低UPR基因诱导。
- 研究意义
- 为携带KEAP1突变或NRF2过度激活肿瘤的患者分层为可能对靶向SLC33A1抑制有应答者提供依据，并强调功能遗传方法与GEMMs整合识别基因型特异性治疗靶点的价值。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
Slc33a1依赖性验证及NRF2依赖性分析
验证Slc33a1为Keap1突变特异性依赖，并确定该依赖是否由NRF2活性介导。
在KP和KPK细胞中进行sgSlc33a1荧光竞争实验、集落形成实验、sgRNA抗性cDNA rescue，并在Nrf2敲除背景下检测Slc33a1缺失效应；在人KEAP1突变细胞系中进行荧光竞争实验。
Slc33a1缺失的转录组和UPR表型分析
探究Slc33a1缺失引起的转录组变化及未折叠蛋白反应。
对KPK等基因对1进行sgCtrl或sgSlc33a1靶向后的RNA-seq和GSEA；Western blot检测自噬和UPR标志物；qPCR验证UPR和NRF2靶基因。
GSH合成抑制rescue实验
检验抑制GSH合成是否能rescue Slc33a1缺失引起的生长缺陷和UPR诱导。
用BSO、Erastin、NAC、DMG、Auranofin等处理sgSlc33a1靶向的KP和KPK细胞及人KEAP1突变细胞系，进行荧光竞争实验和qPCR。
代谢组学分析
表征Slc33a1缺失引起的极性和分泌代谢物变化。
对KP和KPK细胞sgCtrl或sgSlc33a1靶向后在BSO处理48小时或撤药后48小时进行LC-MS和GC-MS分析。
体内移植瘤和GEMM验证
在体内验证Slc33a1作为Keap1突变LUAD的可靶向依赖。
将sgCtrl或sgSlc33a1靶向的KP/KPK细胞皮下移植到免疫缺陷小鼠；用多西环素诱导shRNA敲低Slc33a1；用人A549、H2009、H441细胞系异种移植；在KPC和KPKC GEMM中气管内感染pUSEC-sgSlc33a1或sgCtrl，20周后分析肿瘤负荷和分级。
全基因组CRISPR筛选鉴定Slc33a1依赖抑制基因
无偏筛选可rescue Slc33a1缺失的基因，并探索Slc33a1依赖的生物学机制。
在KPK-Slc33a1敲除细胞中感染Brie全基因组文库，在BSO或vehicle条件下培养8次群体倍增，测序分析富集sgRNA。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Corning | 10-013-CV |
| L-谷氨酰胺 | Gibco | 25030 | |
| 庆大霉素 | Gibco | 15710 | |
| 嘌呤霉素 | Gibco | A11138 | |
| lenti-Cas9-Blast质粒 | Addgene | 52962 | |
| 药物处理 | L-丁硫氨酸亚砜亚胺 | Sigma Aldrich | -- |
| 金诺芬 | TOCRIS bioscience | -- | |
| Erastin | Sigma Aldrich | -- | |
| N-乙酰-L-半胱氨酸 | Sigma Aldrich | -- | |
| 二甲基-2-氧戊二酸 | Sigma Aldrich | -- | |
| 多西环素 | Sigma | D9891 | |
| 活力检测 | Cell Titer Glo试剂盒 | Promega | G7570 |
| Western blot | RIPA裂解液 | Pierce | 89900 |
| Complete Mini蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | 11836153001 | |
| Bio-Rad DC蛋白定量试剂盒 | Bio-Rad | 500-0114 | |
| 抗GAPDH抗体 | Santa Cruz | sc-25778 | |
| 抗HSP90抗体 | BD | 610418 | |
| 抗NRF2抗体 | Santa-Cruz | sc-722 | |
| 抗KEAP1抗体 | CST | 8047 | |
| 抗GCLC抗体 | Santa Cruz | sc-22755 | |
| 抗p62抗体 | CST | 23214 | |
| 抗LC3抗体 | CST | 12741 | |
| 抗BECLIN抗体 | CST | 3495 | |
| 抗磷酸化S6K T421/424抗体 | CST | 9204 | |
| 抗BiP抗体 | CST | 3177 | |
| 抗FLAG抗体 | CST | 14793 | |
| 抗HH3抗体 | CST | 4499 | |
| 抗GCN2抗体 | CST | 65981S | |
| 抗PERK抗体 | CST | 5683S | |
| 抗ATF4抗体 | CST | 11815S | |
| 抗eIF2A抗体 | CST | 5324S | |
| 抗磷酸化eIF2A S51抗体 | CST | 3398S | |
| 抗SLC33A1抗体 | Sigma | HPA042430 | |
| 免疫组化 | 抗磷酸化组蛋白H3（pHH3）（Ser10）抗体 | Cell Signaling | 9701 |
| 抗NQO1抗体 | Sigma Aldrich | HPA007308 | |
| 慢病毒生产 | TransIT-LT1转染试剂 | Mirus Bio | MR 2306 |
| psPAX2包装质粒 | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G包装质粒 | Addgene | 12259 | |
| OptiMEM培养基 | Gibco | 31985-062 | |
| CRISPR文库 | lentiGuide-Puro质粒 | Addgene | 52963 |
| Brie全基因组文库 | Addgene | 73633 | |
| CRISPRi | pLV hU6-sgRNA hUBC-dCas9-KRAB-T2A-Puro质粒 | Addgene | 71236 |
| 基因组DNA提取 | 蛋白酶K | QIAGEN | 19131 |
| RNase A | QIAGEN | 19101 | |
| TE缓冲液 | Sigma | T9285 | |
| PCR纯化 | QIAquick PCR纯化试剂盒 | QIAGEN | 28104 |
| 凝胶回收 | QIAquick凝胶回收试剂盒 | QIAGEN | 28704 |
| 质粒构建 | Gibson组装预混液 | New England Biolabs | E2611S |
| PfuUltra II Fusion HS DNA聚合酶 | Agilent Technologies | 600670 | |
| Endura电感受态细胞 | Lucigen | 60242 | |
| 质粒纯化 | QIAGEN质粒Plus Maxi试剂盒 | QIAGEN | 12963 |
| qPCR | RNeasy Plus Mini试剂盒 | Qiagen | -- |
| High Capacity cDNA逆转录试剂盒 | Applied Biosystems | 4368814 | |
| LC-MS | 血库生理盐水 | Azer Scientific | ES1244G |
| 细胞培养 | 基质胶 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 可成药基因组CRISPR筛选 | 文库靶向基因数、sgRNA数、细胞模型、MOI、时间点、测序深度 阅读提示：Methods中“Infection of cells with the druggable genome library”和“Screen deconvolution and analysis (druggable genome library)” |
| 荧光竞争实验 | sgRNA序列、荧光标记载体、归一化时间点、技术重复数 阅读提示：Methods中“In vitro competition assays”及图1、图3图注 |
| GSH合成抑制处理 | BSO、Erastin、Auranofin、NAC、DMG浓度及处理时间 阅读提示：Methods中“Cell culture”和图3图注 |
| 移植瘤实验 | 细胞数量、基质胶比例、注射体积、小鼠品系、多西环素诱导时机 阅读提示：Methods中“Mice”和图5图注 |
| GEMM实验 | 小鼠基因型、慢病毒滴度、感染途径、分析时间点、肿瘤负荷定量方法 阅读提示：Methods中“Mice”和图6图注 |
| 全基因组CRISPR筛选 | Brie文库sgRNA数、细胞模型、MOI、BSO浓度、覆盖率、时间点 阅读提示：Methods中“Infection of cells with the Brie library”和“Screen deconvolution and analysis (Brie library)” |