小鼠感染模型建立与致病性评估
检验Ifitm3缺失是否在体内增加流感病毒致病性。
Ifitm3−/−和WT同窝小鼠鼻内接种A/X-31或pH1N1/09，每日记录体重和临床体征，生存分析。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
IFITM3限制流感相关疾病发病率和死亡率
IFITM3 restricts the morbidity and mortality associated with influenza.
实验完整度
高使用Ifitm3−/−小鼠、MEF、A549、LCL及住院患者样本，并进行病毒载量、病理、免疫细胞、细胞因子和功能验证。
主要模型
Ifitm3−/−小鼠与野生型同窝对照 小鼠胚胎成纤维细胞（MEF） A549肺癌细胞系 HapMap淋巴母细胞样细胞系（LCL）
重点核对
小鼠基因型：Ifitm3−/−与野生型同窝对照，8-10周龄，>95% C57BL/6背景 病毒接种：A/X-31 10^4 PFU、pH1N1/09 200 PFU、PR/8 50-10^3 PFU，鼻内接种50μl 体外感染：MEF以A/X-31 MOI 0.3-0.4或PR/8 MOI 0.4感染；LCL以WSN/33 MOI 0.1感染 IFN处理：MEF用IFN-α 500-2500 U/ml或IFN-γ 100-300 ng/ml预处理24h；LCL用IFN-α2 100 U/ml处理16h 患者SNP rs12252基因型与1000 Genomes对照比较
摘要
2009年H1N1流感大流行显示了新型呼吸道病毒传播的速度，以及一种通常轻微的感染如何在少数不幸者中引发严重疾病和死亡。近期体外研究表明，干扰素诱导跨膜（IFITM）蛋白家族成员能有效限制多种致病病毒的复制。IFITM蛋白体外效应的幅度和广度提示它们对包括流感病毒在内的此类病毒的内在抵抗至关重要。利用基因敲除小鼠模型，我们现在直接检验这一假说，发现IFITM3对于在体内防御宿主抵抗甲型流感病毒至关重要。缺失Ifitm3的小鼠在受到通常低致病性流感病毒攻击时表现出暴发性病毒性肺炎，再现了高致病性1918年“西班牙”流感造成的破坏。体外也观察到类似的病毒复制增加，而重新引入Ifitm3可挽救保护作用。为了检验IFITM3在人流感病毒感染中的作用，我们评估了因季节性流感或2009年H1N1大流行流感病毒住院个体的IFITM3等位基因。我们发现，统计学显著数量的住院受试者显示出对一种改变剪接受体位点的次要IFITM3等位基因（SNP rs12252-C）的富集，功能实验显示次要CC基因型IFITM3在体外对流感病毒的限制作用降低。总之，这些数据揭示单一内在免疫效应分子IFITM3的作用深刻改变了小鼠和人类流感病毒感染的进程。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- IFITM3在体内是否对防御甲型流感病毒感染至关重要，以及人类IFITM3遗传变异是否与流感住院风险相关。
- 核心机制
- IFITM3作为内在免疫效应分子限制流感病毒复制；其缺失导致肺部病毒复制失控和过度炎症反应，而rs12252-C等位基因改变剪接受体位点，可能产生N端缺失21个氨基酸的IFITM3，降低病毒限制能力。
- 主要证据
- Ifitm3−/−小鼠感染低致病性A/X-31或pH1N1/09后出现暴发性肺炎、体重下降和死亡，肺部病毒载量升高；MEF和A549细胞中Ifitm3缺失或NΔ21突变降低病毒限制；住院流感患者中rs12252-C等位基因富集，CC基因型LCL对流感更易感。
- 研究意义
- IFITM3可能塑造流感病毒的临床病程，IFITM3功能受损个体及人群中比例较高者可能对新大流行病毒的初始建立和传播更易感。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
肺部病毒载量与扩散检测
评估Ifitm3缺失对病毒复制和肺部扩散的影响。
感染后不同时间点收集肺组织， plaque assay和RT-qPCR检测病毒载量；免疫组化和原位杂交检测病毒蛋白和RNA分布。
肺病理和细胞凋亡分析
明确Ifitm3缺失导致的肺组织损伤和细胞凋亡程度。
H&E染色评估肺病理，TUNEL检测细胞凋亡。
免疫细胞和细胞因子分析
探究Ifitm3缺失对肺部免疫细胞组成和炎症因子的影响。
流式细胞术分析肺 resident细胞群；外周血白细胞分类计数；Luminex检测肺匀浆细胞因子/趋化因子。
体外细胞感染与功能挽救实验
验证Ifitm3缺失对病毒复制的细胞自主影响及重新表达的保护作用。
MEF转导表达Ifitm3或空载体，IFN处理后再感染A/X-31或PR/8，免疫荧光检测病毒蛋白；A549稳定表达全长或NΔ21 IFITM3，感染多种流感毒株。
人类IFITM3 SNP rs12252与流感住院关联分析
检验IFITM3遗传变异是否与人类流感住院风险相关。
对53例因流感住院患者IFITM3位点测序，比较SNP rs12252等位基因频率与1000 Genomes对照；分析LCL中TT和CC基因型对流感感染的易感性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 病毒载量检测 | Leibovitz L-15培养基 | Invitrogen | -- |
| 抗生素-抗真菌剂 | Invitrogen | -- | |
| RNeasy Mini Plus试剂盒 | Qiagen | -- | |
| SYBR Green | Qiagen | -- | |
| StepOnePlus仪器 | Applied Biosystems | -- | |
| Western blot | 组织蛋白提取试剂 | Thermo Scientific | -- |
| cOmplete蛋白酶抑制剂 | Roche | -- | |
| BCA测定 | Thermo Scientific | -- | |
| 小鼠Ifitm2兔多克隆抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-66828 | |
| 抗fragilis（Ifitm3）兔多克隆抗体 | Abcam | ab15592 | |
| 抗IFITM1抗体 | Prosci | 5807 | |
| 兔抗IFITM3（N端aa 8-38） | Abgent | AP1153a | |
| 兔抗MX1 | Proteintech | 13750-1-AP | |
| 小鼠抗GAPDH（克隆GAPDH-71.1） | Sigma | G8795 | |
| 肌动蛋白抗体，小鼠单克隆 | Abcam or Sigma | A5316 | |
| 病理检测 | TACS XL DAB原位细胞凋亡检测试剂盒 | R&D Systems | -- |
| 免疫荧光组织染色 | 甲基丙烯酸羟乙酯 | -- | -- |
| RPMI 1640培养基 | Invitrogen | -- | |
| 胎牛血清 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 牛血清白蛋白 | Invitrogen | -- | |
| M149甲/乙型流感多克隆抗体 | Takara | -- | |
| AP标记的山羊抗兔二抗 | Dako | -- | |
| 抗IFITM1抗体 | Abcam | ab106265 | |
| 抗fragilis（抗Ifitm3）兔多克隆抗血清 | Abcam | ab15592 | |
| Hoechst 33342 | Sigma | -- | |
| 免疫荧光RNA染色 | QuantiGene viewRNA试剂盒 | Affymetrix | -- |
| 流式细胞术 | 红细胞裂解液 | eBioscience | -- |
| FACSAria II流式细胞仪 | BD Bioscience | -- | |
| 外周血白细胞分析 | Wright-Giemsa染色 | Sigma-Aldrich | -- |
| 细胞因子检测 | 小鼠抗体磁珠试剂盒 | Millipore | -- |
| Luminex FlexMAP3D | -- | -- | |
| MEF培养与转导 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| MEM必需氨基酸 | Gibco | -- | |
| pQXCIP载体 | Clontech | -- | |
| MEF感染检测 | 抗HA单克隆抗体（杂交瘤HA36-4-5.2） | Wistar Institute | -- |
| NP（克隆H16-L10-4R5）小鼠单克隆抗体 | Millipore | MAB8800 | |
| Alexa Fluor 488山羊抗小鼠二抗 | Invitrogen | A11001 | |
| Image Express Micro显微镜 | Molecular Devices | -- | |
| 细胞因子处理 | 鼠干扰素α | PBL Interferon Source | 12100-1 |
| 干扰素γ | PBL Interferon Source | 12500-2 | |
| A549培养与转导 | A549细胞 | ATCC | CCL-185 |
| DMEM培养基 | Invitrogen | 11965 | |
| 胎牛血清 | Invitrogen | -- | |
| pQXCIP载体 | Clontech | -- | |
| A549感染检测 | 抗IFITM3抗体（CIL） | Proteintech | -- |
| 抗NP抗体 | Abcam | -- | |
| 抗甲型流感病毒抗体（克隆H16-L10-4R5） | Millipore | -- | |
| LCL培养与感染 | RPMI-1640培养基 | Sigma-Aldrich | -- |
| 重组人IFN-α2 | PBL Interferon Source | 11100 | |
| BD Cytofix/Cytoperm固定/透化试剂盒 | BD Biosciences | -- | |
| FITC标记的抗甲型流感病毒NP小鼠单克隆抗体（克隆431） | Abcam | ab20921 | |
| BD FACS Calibur流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| DNA提取 | Nucleon试剂盒 | GenProbe | -- |
| 测序 | QiaQuick凝胶提取试剂盒 | Qiagen | -- |
| Applied Biosystems 3730×l DNA分析仪 | GATC Biotech | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠感染模型 | 小鼠基因型（Ifitm3−/−与WT同窝对照）、年龄（8-10周龄）、背景（>95% C57BL/6）、每组n>5、病毒株（A/X-31 10^4 PFU；pH1N1/09 200 PFU；PR/8 50-10^3 PFU）、接种体积50μl、鼻内接种、体重监测和安乐死阈值（>25%体重下降） 阅读提示：Methods in Full: Mouse infection |
| 病毒载量检测 | 每个基因型每个时间点5只小鼠、感染后第1、2、3、4、6天收集肺组织、肺匀浆比例5% w/v、空斑试验用MDCK细胞、RT-qPCR引物和检测的器官（肺、心、脑、脾） 阅读提示：Methods in Full: Influenza virus quantification |
| 体外细胞感染实验 | MEF感染MOI（A/X-31 0.3-0.4；PR/8 0.4）和检测时间（12h）；A549感染后12h检测；LCL以WSN/33 MOI 0.1感染18h后检测；IFN处理浓度和时间（IFN-α 500-2500 U/ml，IFN-γ 100-300 ng/ml，24h；IFN-α2 100 U/ml，16h） 阅读提示：Methods in Full: Murine embryonic fibroblast generation, transduction, and infectivity assays; A549 transduction and infectivity assays; LCL infectivity assays |
| 人类遗传关联分析 | 患者纳入标准、样本量（53例）、SNP rs12252基因型、对照人群（1000 Genomes、WTCCC1、荷兰和德国数据集）、统计方法（Fisher精确检验） 阅读提示：Methods in Full: Ethics and sampling; Sequencing and Genetics |