家系临床样本收集与表型评估
确认患者家系中BRA的诊断，收集DNA和临床数据。
收集近亲婚配汉族家庭中两名受影响胎儿（II:3和II:4）及其父母和姐姐的DNA样本，来源包括羊水、胎儿皮肤组织和外周血；进行了超声检查和组织病理学检查确认BRA。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
肾连蛋白双等位基因移码突变导致人类双侧肾发育不全
A Biallelic Frameshift Mutation in Nephronectin Causes Bilateral Renal Agenesis in Humans
实验完整度
高包括WES结合纯合定位、体外过表达实验和CRISPR/Cas9敲入小鼠模型，并进行了组织学和表达验证。
主要模型
HEK293T细胞 NpntK260*敲入小鼠（C57BL/6背景） 近亲婚配汉族家庭（患者及家系成员）
重点核对
WES数据质量：测序深度≥30，等位基因频率≤0.1 纯合区域共享：长度≥1 Mb，SNP密度≥1/1200 kb，SNP数≥4 敲入小鼠基因型确认：F2代纯合、杂合、野生型比例 NPNT蛋白表达检测：Western blot（肺组织） 小鼠肾表型观察：0 dpp解剖，统计双侧肾缺如比例
摘要
背景：双侧肾发育不全（BRA）是一种致命的先天性异常，由胚胎发育早期双肾正常发育失败引起。胎儿超声检查发现羊水过少可提示BRA。尽管确切病因尚不清楚，但BRA与许多肾脏发育基因的突变有关。然而，分子诊断未能检出许多临床患者。肾连蛋白（NPNT）可能是扩大诊断的候选蛋白。它在肾脏发育中必不可少，小鼠中Npnt基因敲除常导致肾发育不全或发育不良。方法：一个近亲结婚的汉族家庭因疑似BRA在妊娠中期经历了三次人工流产。基于全外显子组测序（WES）的纯合性定位检测了潜在遗传因素，并通过敲入小鼠模型确认了肾发育不全表型。结果：WES和II:3与II:4纯合区域评估揭示了NPNT中一个致病性纯合移码变异（NM_001184690:exon8:c.777dup/p.Lys260*），该变异导致下一个密码子出现提前终止。截短的NPNT蛋白表达下降，并通过在体内过表达WT和突变型NPNT得到证实。携带所检出的Npnt突变纯合的敲入小鼠复制了BRA表型。结论：通过敲入小鼠的相应表型证实了NPNT双等位基因功能丧失突变导致人类常染色体隐性遗传形式的BRA。我们的结果揭示了BRA的一个新的遗传原因，为BRA家庭的遗传诊断、产前诊断和植入前诊断提供了新靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- NPNT基因突变是否导致人类双侧肾发育不全（BRA）？
- 核心机制
- NPNT双等位基因功能丧失突变导致截短蛋白，其RGD基序和MAM结构域缺失，可能影响与整合素α8β1的结合及GDNF表达，从而干扰肾脏发育。
- 主要证据
- 通过WES和纯合定位在患者中发现NPNT纯合移码突变；体外过表达显示突变导致mRNA和蛋白表达降低；敲入小鼠模型纯合突变体表现双侧肾缺如表型。
- 研究意义
- 揭示NPNT是BRA的新遗传原因，为BRA家庭的遗传诊断、产前诊断和植入前诊断提供新靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
全外显子测序和纯合定位分析
鉴定候选致病基因和突变。
对五个家庭成员进行WES，基于WES数据进行纯合定位（ROH分析），筛选共享纯合区域的罕见变异。
突变验证和家系共分离分析
确认WES鉴定的NPNT突变，并验证其在家系中的共分离。
通过Sanger测序验证突变，并对家系所有成员进行基因分型。
体外过表达实验
研究NPNT突变对mRNA和蛋白表达的影响。
在HEK293T细胞中通过慢病毒感染过表达野生型（WT-NPNT）和突变型（K260ter-NPNT）NPNT，检测mRNA和蛋白水平。
构建敲入小鼠模型
在体内验证NPNT突变是否导致BRA表型。
利用CRISPR/Cas9技术在C57BL/6小鼠中引入Npnt-c.777dup/p.Lys260*突变，生成敲入小鼠，并通过杂交获得纯合小鼠，观察肾脏表型。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 全外显子测序 | Illumina NovaSeq6000测序仪 | Illumina | -- |
| IDT XGen外显子研究panel | IDT | -- | |
| Sanger测序 | ABI-A3500遗传分析仪 | ABI | -- |
| 细胞培养和病毒感染 | 293T细胞 | China Center for Type Culture Collection | GDC187 |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| 逆转录PCR | PrimeScript RT试剂盒（含gDNA Eraser） | TaKaRa | -- |
| 实时定量PCR | SYBR Green实时PCR预混液 | Toyobo | -- |
| Western blot | NPNT/Npnt抗体 | SCBT | sc-393033 |
| FLAG抗体 | CST | 8146 | |
| β-微管蛋白抗体 | ABclonal | AC008 | |
| WesternBright ECL底物 | Advansta | -- | |
| 数据分析 | SPSS软件 | IBM | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 全外显子测序 | 测序平台、捕获panel、比对软件、ROH筛选参数、变异筛选条件 阅读提示：Methods: Whole-exome Sequencing–based Homozygosity Mapping |
| 突变验证 | Sanger测序使用的引物、PCR条件 阅读提示：Methods: WES Data Analysis and Sanger Sequencing; Supplemental Table 2 |
| 体外过表达 | 细胞系、感染时间、转染效率、检测方法 阅读提示：Methods: Cell Culture and Transfection with Lentivirus; Figure 2 |
| 敲入小鼠模型 | gRNA序列、供体寡核苷酸、显微注射程序、基因分型方法、观察时间点 阅读提示：Methods: Generation of Npnt-c.777dup/p.Lys260* Mice; Figure 3 |
| 表型分析 | 小鼠年龄（0 dpp）、解剖方法、组织学染色方法 阅读提示：Methods: Histology Assay; Figure 4 |