构建绝缘子报告系统
在mESCs中建立定量检测绝缘子增强子阻断活性的体系
通过CRISPR-Cas9同源重组在F123 mESC的Sox2基因座引入egfp（CAST）和mcherry（129）标签，并在Sox2与超级增强子之间插入含HyTK负筛选标记的可替换盒。
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CTCF通过形成局部染色质结构域介导剂量和序列背景依赖的转录绝缘
CTCF mediates dosage- and sequence-context-dependent transcriptional insulation by forming local chromatin domains
实验完整度
高包含体外细胞模型（mESCs）绝缘子报告系统、基因编辑（CRISPR-Cas9）、ChIP-seq、RNA-seq、PLAC-seq、Hi-C及多重FISH成像等多种独立证据层级，并进行功能与机制验证。
主要模型
小鼠胚胎干细胞（mESCs）F123杂交系 Sox2基因座绝缘子报告系统 CTCF锌指9-11缺失突变体
重点核对
绝缘子插入位置为Sox2基因与下游超级增强子之间（CAST等位基因） 单个CTCF结合位点（CBS）数量（1至4个） CTCF结合位点方向（正向、反向、趋异、趋同） CBS侧翼序列长度（139bp、60bp、20bp、10bp） CTCF锌指9-11是否缺失
摘要
绝缘子在动物时空基因调控中发挥关键作用。进化上保守的CCCTC结合因子（CTCF）是哺乳动物绝缘子功能所必需的，但并非其所有结合位点都发挥绝缘子作用。在此，我们利用小鼠胚胎干细胞（mESCs）中的灵敏绝缘子报告系统，探索了CTCF介导的转录绝缘的序列需求。我们发现绝缘效力取决于串联CTCF结合位点的数量。此外，CTCF介导的绝缘作用依赖于其结合位点的上游侧翼序列。位于拓扑关联结构域（TAD）边界的CTCF结合位点比TAD边界外的位点更可能发挥绝缘子功能，这与其结合强度无关。我们证明绝缘子形成局部染色质结构域边界，并削弱增强子-启动子接触。综上所述，我们的结果提供了连接染色质拓扑与哺乳动物基因组中绝缘子作用的遗传学、分子和结构学证据。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CTCF如何以及在何处介导转录绝缘，其序列要求和染色质拓扑作用是什么？
- 核心机制
- CTCF介导的转录绝缘依赖于串联CBS的剂量和结合位点上游10-20bp侧翼序列，后者可能通过与CTCF锌指9-11的接触促进绝缘。绝缘子通过形成局部TAD边界，削弱增强子与启动子之间的有效接触，从而降低转录爆发频率。
- 主要证据
- 在mESCs中，使用Sox2绝缘子报告系统，通过FACS检测Sox2表达变化，结合ChIP-seq、PLAC-seq、Hi-C和多重DNA/RNA FISH，证明多个CBS串联和边界相关侧翼序列增强绝缘，且绝缘子形成局部染色质结构域并减少增强子-启动子接触。
- 研究意义
- 该研究揭示了CTCF位点并非等价，其绝缘功能取决于剂量和上游侧翼序列，解释了TAD边界CBS更可能作为绝缘子的原因，并为染色质拓扑与绝缘子功能之间的联系提供了机制见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
测试单个及多个CTCF结合位点的绝缘活性
比较不同CBS数量及方向对转录绝缘的影响
通过RMCE将PCR扩增的单个或多个CBS插入Sox2报告系统，通过FACS测量等位基因特异性Sox2-eGFP表达。
序列需求分析（合成绝缘子）
确定CTCF结合位点侧翼序列对绝缘功能的要求
合成由多个139bp CBS组成的串联序列，并构建侧翼序列交换、截短或缺失CTCF核心基序的变异体，测试其绝缘活性。
验证CTCF锌指9-11的作用
检验CTCF锌指9-11是否参与侧翼序列依赖的绝缘功能
利用CRISPR介导的内源CTCF基因编辑，删除编码锌指9-11的序列，并在报告系统中测试对绝缘活性的影响。
染色质结构分析
揭示绝缘子对局部染色质拓扑和增强子-启动子接触的影响
对插入CBS的mESC克隆进行PLAC-seq和Hi-C实验，分析等位基因特异性染色质接触和TAD结构变化。
单细胞成像验证
在单细胞水平观察绝缘子对染色质结构和转录爆发的影响
使用多重DNA FISH和RNA FISH同时追踪210kb Sox2区域的染色质构象和转录活性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | PD03259010 | -- | -- |
| CHIR99021 | -- | -- | |
| Accutase | -- | AT104 | |
| 白血病抑制因子 | -- | -- | |
| 遗传工程 | pX330 | addgene | 42230 |
| Neon转染系统 | -- | MPK1096 | |
| pFlpe | addgene | 13787 | |
| RMCE克隆 | NotI-HF限制酶 | neb | R3642S |
| SbfI-HF限制酶 | neb | R3189S | |
| 快速去磷酸化酶 | neb | M0371S | |
| QIAGEN质粒中提试剂盒 | QIAGEN | 12943 | |
| 细胞培养 | 更昔洛韦 | -- | -- |
| 基因分型 | DNeasy血液和组织试剂盒 | QIAGEN | 69581 |
| FACS分析 | 索尼分选仪SH800 | Sony | -- |
| FACS管 | -- | SKU: | |
| ChIP-seq | Covaris truChIP染色质剪切试剂盒 | Covaris | PN520154 |
| Covaris M220超声破碎仪 | Covaris | -- | |
| CTCF抗体 | Abcam | ab70303 | |
| Rad21抗体 | Abcam | ab992 | |
| H3K4me3抗体 | Millipore | 04-745 | |
| H3K27ac抗体 | Active Motif | 39685 | |
| 蛋白G琼脂糖珠 | GE | 17061801 | |
| 蛋白酶K | NEB | P8107S | |
| SPRI磁珠 | -- | -- | |
| Qubit高灵敏度双链DNA定量试剂盒 | -- | Q32854 | |
| RNA-seq | TRIzol Plus RNA纯化试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 12183555 |
| Illumina TruSeq链特异性mRNA文库制备试剂盒 | Illumina | RS-122-2101, | |
| PLAC-seq | MboI限制酶 | NEB | -- |
| T4 DNA连接酶缓冲液 | NEB | -- | |
| Dynabeads M-280羊抗兔IgG磁珠 | -- | 11203D | |
| Zymo DNA清洁和浓缩试剂盒-5 | Zymo | -- | |
| myOne T1链霉亲和素Dynabeads | -- | -- | |
| QIAseq超低起始量文库制备试剂盒 | Qiagen | 180492 | |
| 多重FISH成像 | Oligopaint探针 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系：F123杂交mESC系；培养基：2i/LIF条件；传代方法：Accutase消化，明胶包被培养皿；培养条件：每日更换培养基。 阅读提示：Methods: Cell culture |
| 绝缘子报告系统构建 | Sox2基因标签（egfp/mcherry）；CRISPR-Cas9靶向Sox2 3'端；插入位点位于Sox2基因与超级增强子之间；使用RMCE插入供体序列。 阅读提示：Methods: Genetic engineering of the Sox2 locus |
| 绝缘子插入 | CBS来源（如Sox9-Kcnj2 TAD边界）；CBS数量（1-4个）；插入方向（正向、反向）；侧翼序列长度（139bp、60bp、20bp、10bp）；使用更昔洛韦筛选。 阅读提示：Methods: Marker-free insertion in mESCs by RMCE |
| FACS分析 | 细胞染色：GFP和mCherry；门控策略（SSC-A/FSC-A, FSC-A/FSC-H）；数据标准化（eGFP/mCherry比率）；每克隆至少3个独立克隆。 阅读提示：Methods: FACS data acquisition and analysis |
| ChIP-seq | 交联条件（1%甲醛15分钟）；超声参数（Covaris M220，功率75W，10分钟）；抗体（CTCF ab70303, Rad21 ab992, H3K4me3 Millipore 04-745, H3K27ac Active Motif 39685）；数据分析流程。 阅读提示：Methods: ChIP-seq |