Nova-ST芯片制备
从NovaSeq流动池制备具有空间条形码的RNA捕获芯片
对NovaSeq 6000 S4流动池进行HDMI测序生成空间条形码，经DraI酶切、外切核酸酶和磷酸酶处理，手动或自动切割成芯片，清洗并储存。
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Nova-ST：用于空间转录组学的纳米图案化超高密度平台
Nova-ST: Nano-patterned ultra-dense platform for spatial transcriptomics.
实验完整度
高包含小鼠脑组织切片空间转录组测序、多芯片重复性验证、与Stereo-seq/Slide-seqV2/Visium HD/osmFISH等多平台基准比较及计算流程验证。
主要模型
小鼠脑冠状冷冻切片（10 μm） Nova-ST芯片（NovaSeq 6000 S4流动池来源） Stereo-seq小鼠脑切片（内部生成及公开数据）
重点核对
小鼠脑冷冻切片厚度10 μm，取自C57BL/6J雄性小鼠6–8周龄 Nova-ST芯片来自NovaSeq 6000 S4流动池，手动或自动切割成1×1 cm等尺寸 组织透化时间：小鼠脑27分钟（基于Visium优化试剂盒确定） 测序深度：深层测序约12亿reads，浅层测序7700万–1.4亿reads 重复数：7个重复（5个来自FC1，2个来自FC2），包含厚玻璃和薄玻璃层芯片
摘要
Poovathingal等人开发了Nova-ST，一种基于Illumina NovaSeq测序流动池的低成本、全转录组空间工作流程。纳米图案化结构允许对来自不同物种和组织类型的大组织切片进行高分辨率、单细胞空间分析。Nova-ST以极低的成本提供与其他可比技术相当或更优的性能。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否利用Illumina NovaSeq流动池的纳米图案化表面，建立低成本、高分辨率、可定制的大组织切片空间转录组学平台？
- 核心机制
- 通过HDMI测序在NovaSeq流动池纳米孔中生成随机空间条形码，经酶切暴露RNA捕获位点，结合组织透化、逆转录和文库构建，实现全转录组空间捕获；计算流程利用基准标记将条形码坐标全局对齐并映射基因表达。
- 主要证据
- 小鼠脑切片空间基因表达与Allen Brain Atlas及ISH数据高度一致，无偏聚类可分辨皮层各层和海马亚区；与Stereo-seq相比在相同测序深度下检测到更多基因和UMIs；7个重复芯片间性能一致。
- 研究意义
- Nova-ST提供开源、物种无关、低成本的大规模空间转录组学方案，成本约为Stereo-seq和Visium HD标价的17%，并展示了对NovaSeq X流动池的适应性。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
组织透化时间优化
确定小鼠脑组织最佳透化时间以平衡RNA捕获信号强度和扩散
使用10× Genomics Visium Spatial Optimization kit，以胃蛋白酶（1 mg/mL in 0.1N HCl）在不同时间处理小鼠脑切片，评估荧光信号强度和清晰度。
空间转录组捕获与文库构建
在Nova-ST芯片上进行组织RNA捕获、逆转录和文库扩增
将10 μm冷冻切片置于Nova-ST芯片，H&E染色成像，透化后逆转录过夜，外切核酸酶处理，组织清除，第二链合成，RPE PCR和索引PCR，最终文库测序。
性能评估与重复性验证
评估Nova-ST芯片的空间分辨率、灵敏度和重复性
对7个重复芯片进行测序，比较厚/薄玻璃层和不同流动池来源芯片的质量指标；将基因表达与Allen Brain Atlas和ISH数据比较；使用cell2location映射scRNA-seq数据。
与其他空间技术的基准比较
比较Nova-ST与Stereo-seq、Slide-seqV2、Visium HD和osmFISH的性能
在相同测序深度下比较基因/UMI检测数；使用选定脑区（皮层、胼胝体、CA1）比较每基因捕获效率；与osmFISH数据比较RNA捕获效率。
NovaSeq X流动池适配测试
验证Nova-ST工作流程能否适配新一代NovaSeq X流动池
使用自动切割策略切割X-25B流动池，电子显微镜表征纳米孔密度，评估芯片产量和尺寸。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
组织透化优化
空间转录组捕获与文库构建
基准比较与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| HDMI测序 | Illumina NovaSeq 6000 S4试剂盒；35循环 | Illumina, Inc | 20044417 |
| HDMI-DraI32寡核苷酸 | IDT Technologies | -- | |
| Read1-DraI32引物 | IDT Technologies | -- | |
| KAPA Illumina平台文库定量试剂盒 | Kapa Biosystems | KK4835 | |
| 流动池后处理 | DraI限制性内切酶 | New England Biolabs | R0129L |
| 外切核酸酶I（大肠杆菌） | New England Biolabs | M0293L | |
| Quick CIP | New England Biolabs | M0525L | |
| SYLGARD 184硅橡胶试剂盒 | Dow Corning | 101697 | |
| 流动池切割 | NOMAD 3 CNC铣床 | Carbide3D | -- |
| DAD 3220切割机 | DISCO | -- | |
| 组织透化优化 | Visium空间基因表达试剂盒 | 10x Genomics, Inc | 1000192 |
| 猪胃黏膜胃蛋白酶 | Merck MilliporeSigma (Sigma-Aldrich) | P7000 | |
| H&E染色 | 返蓝缓冲液 | Agilent | CS702 |
| 伊红Y | Merck Millipore Sigma (Sigma-Aldrich) | HT110216 | |
| 空间转录组捕获 | Maxima H-逆转录缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | EP0753 |
| Maxima H-逆转录酶 | Thermo Fisher Scientific | EP0753 | |
| RNase抑制剂 | Lucigen | 30281-1 | |
| Ficoll PM-400 20%水溶液 | Merck MilliporeSigma (Sigma-Aldrich) | F5415-50ML | |
| dNTP混合物（各25 mM） | Thermo Fisher Scientific | R1121 | |
| 第二链合成 | Klenow片段（3′-5′外切酶-） | New England Biolabs | M0212L |
| 组织清除 | 蛋白酶K | New England Biolabs | P8107S |
| 文库纯化 | Ampure XP磁珠 | Beckman Coulter | A63882 |
| PCR扩增 | HotStart ReadyMix（KAPA HiFi PCR试剂盒） | Kapa Biosystems | -- |
| 文库定量 | Qubit dsDNA定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | Q32851 |
| RNA提取 | innuPREP mini RNA试剂盒 | Analytik Jena | AJ 845-KS-2040250 |
| Stereo-seq空间转录组 | Stereo-seq透化试剂盒 | BGI STomics | 111KP118 |
| Stereo-seq P芯片（1cm×1cm） | BGI STomics | 111CP118 | |
| Stereo-seq转录组T试剂盒 | BGI STomics | 111KT114 | |
| Stereo-seq T芯片（1cm×1cm） | BGI STomics | 110CT114 | |
| Stereo-seq文库制备试剂盒 | BGI STomics | 111KL114 | |
| 核酸定量 | Qubit ssDNA检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | Q10212 |
| 测序 | NextSeq 2000测序平台 | Illumina | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| Nova-ST芯片制备 | HDMI测序循环数（34循环后中止）、DraI酶切条件（37°C过夜）、外切核酸酶/磷酸酶处理时间（37°C 45分钟）、芯片切割尺寸 阅读提示：STAR Methods中“HDMI sequencing”和“Post sequencing processing of the flow cell”小节，以及Figure 1D–1E图注 |
| 组织透化 | 胃蛋白酶浓度（1 mg/mL）、透化时间（小鼠脑27分钟）、透化温度（37°C） 阅读提示：STAR Methods中“Optimization of tissue permeabilization for Nova-ST workflow”小节 |
| 空间转录组捕获与文库构建 | 组织切片厚度（10 μm）、逆转录条件（42°C过夜）、第二链合成时间（37°C 2小时）、PCR循环数（RPE和索引PCR各14循环）、测序配置（R1=34 bp, I1=8 bp, I2=8 bp, R2=91 bp） 阅读提示：STAR Methods中“Nova-ST workflow”各小节及Figure 2A图注 |
| 性能评估 | 重复数（7个）、测序深度（深层约12亿reads，浅层7700万–1.4亿reads）、binning大小（bin50/100/200） 阅读提示：Results中“Performance assessment of Nova-ST”小节及Figure 3C和3E图注 |
| 基准比较 | 比较数据集来源（Stereo-seq内部、Chen et al.、You et al.、Slide-seqV2、Visium HD、osmFISH）、选定脑区（皮层、胼胝体、CA1）、测序深度标准化方法 阅读提示：Results中“Comparison of Nova-ST with existing sequencing-based ST technologies”小节及Figure 4图注 |