构建人卵巢单核转录组图谱
鉴定人卵巢细胞类型及其随年龄的转录组变化
对4例人卵巢组织（12、32、34、42岁）进行snRNA-seq，整合公共数据共12例卵巢，质控后鉴定12种细胞类型，分析年龄相关差异表达基因和细胞身份变化
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衰老人类卵巢的空间转录组特征
Spatial Transcriptomic Characteristics of the Aging Human Ovary.
实验完整度
高包含snRNA-seq、scStereo-seq空间转录组、免疫荧光验证、细胞系过表达功能实验及人原代细胞qPCR验证。
主要模型
12例人类卵巢组织（年龄12-54岁） 人颗粒细胞系SVOG 人原代颗粒细胞（来自辅助生殖技术治疗患者） 小鼠卵巢scRNA-seq数据（3月龄和9月龄）
重点核对
12例人卵巢组织按年龄分组：青春期前12岁n=1，年轻23-29岁n=4，中年32-34岁n=2，老年42-54岁n=5 snRNA-seq质控标准：检测基因数200-10000，UMI数1000-30000，线粒体UMI比例<20%，双细胞去除 scStereo-seq使用bin 50（50×50 bins）作为分析spot SVOG细胞DLK1过表达：500 ng质粒DNA，48小时孵育后收集细胞 免疫荧光一抗浓度：STAR 1:100，DLK1 1:100，NOTCH3 1:100，CLDN5 1:100，IgG 1:100，PDGFRA 1:50
摘要
卵巢衰老是一个复杂的过程，会损害生育能力并增加生殖系统疾病的风险。为了阐明其时空动态，我们整合了单核RNA测序和空间转录组学技术，构建了涵盖12至54岁（青春期前，12岁，n=1；年轻，23-29岁，n=4；中年，32-34岁，n=2；老年，42-54岁，n=5）的12个人类卵巢组织的全面衰老图谱。我们的分析揭示了衰老相关的转录组变化，包括衰老人卵巢中线粒体氧化磷酸化和生殖结构发育受损。我们鉴定了一种新的内皮细胞（EDC）亚型——CLDN5+血液内皮细胞，其表现出作为半专业抗原呈递细胞的独特功能特化。与其他在衰老过程中失去细胞身份的细胞类型不同，CLDN5+血液内皮细胞对衰老表现出转录组敏感性，其特征是抗原呈递能力增强和炎症活性升高。空间定位进一步揭示了免疫球蛋白表达（IGHG1+/IGKC+）细胞在卵巢周边的积累，并与年龄增长相关。关键的是，衰老破坏了整体细胞连接性，同时放大了膜细胞与CLDN5+血液内皮细胞之间的DLK1:NOTCH3轴，这可能导致了卵巢功能失调。我们还检测到原发性卵巢功能不全患者颗粒细胞中DLK1的上调。本研究显著增强了我们对人类卵巢衰老潜在机制的理解，并同时指出了解决相关疾病的潜在治疗途径。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 人类卵巢衰老过程中的时空转录组动态变化及其细胞类型和细胞间互作特征是什么？
- 核心机制
- 衰老过程中膜细胞分泌的DLK1增加，与CLDN5+血液内皮细胞上的NOTCH3受体相互作用增强，该DLK1:NOTCH3轴可能抑制NOTCH信号，导致卵巢功能失调；同时CLDN5+血液内皮细胞作为半专业抗原呈递细胞，在衰老中抗原呈递能力和炎症活性增强。
- 主要证据
- snRNA-seq和scStereo-seq构建12例人卵巢衰老图谱，鉴定CLDN5+血液内皮细胞亚型及其抗原呈递功能；空间分析发现免疫球蛋白表达细胞在卵巢周边积累；细胞互作分析显示DLK1:NOTCH3轴随年龄增强；免疫荧光验证DLK1蛋白水平与年龄正相关；SVOG细胞过表达DLK1上调p16和p21。
- 研究意义
- 本研究增强了对人类卵巢衰老机制的理解，并为探索相关疾病的潜在治疗干预提供了宝贵资源。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
构建人卵巢空间转录组图谱
在空间维度解析卵巢细胞类型分布及衰老相关空间特征
对4例人卵巢组织（12、32、34、42岁）进行scStereo-seq，使用bin 50分析spot，映射snRNA-seq细胞注释，鉴定空间细胞类型分布和空间热点
鉴定CLDN5+血液内皮细胞亚型及其抗原呈递功能
解析内皮细胞亚型分类、空间分布及衰老相关功能变化
基于snRNA-seq对血液内皮细胞进行亚型分类，DEG分析和GO分析鉴定CLDN5+血液内皮细胞特征，空间转录组验证其分布，分析衰老中抗原呈递相关基因表达变化
分析衰老相关炎症微环境和免疫球蛋白表达细胞积累
鉴定衰老敏感spot及其细胞组成和基因表达特征，验证免疫球蛋白表达细胞随年龄的积累
整合衰老基因集与年龄相关上调DEG鉴定衰老敏感基因，定义top 5% spot为SSS，分析SSS与非SSS的DEG和GO，细胞共现分析，免疫荧光验证IgG+细胞积累
解析细胞间互作及DLK1:NOTCH3轴
揭示衰老过程中细胞连接性变化及关键配体-受体互作
基于scStereo-seq进行配体-受体互作分析，鉴定DLK1:NOTCH3轴，免疫荧光验证DLK1和NOTCH3空间邻近关系，GTEx数据验证表达趋势，人卵泡液样本免疫荧光验证DLK1蛋白水平与年龄相关性
体外功能验证DLK1过表达对颗粒细胞衰老标志物的影响
验证DLK1过表达是否影响衰老标志物表达
在SVOG细胞系中转染DLK1过表达质粒，48小时后RT-qPCR检测DLK1、p16（CDKN2A）和p21（CDKN1A）表达
临床样本验证DLK1和NOTCH3在POI患者中的表达
探索DLK1和NOTCH3表达变化在卵巢疾病中的临床相关性
收集健康年轻女性（<35岁）、健康老年女性（>40岁）和POI患者（<35岁）的原代颗粒细胞，RT-qPCR检测DLK1和NOTCH3表达
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| scStereo-seq | STOmics Stereo-seq转录组试剂盒 | STOmics | 201ST114 |
| STOmics Stereo-seq转录组试剂盒 | STOmics | 201ST004 | |
| 单链DNA荧光染色 | Invitrogen | Q10212 | |
| scStereo-seq文库构建试剂盒 | STOmics | 101KL114 | |
| snRNA-seq | 10× Genomics Chromium Next GEM单细胞3′试剂盒v3.1 | 10× Genomics | PN-1000268 |
| 牛血清白蛋白 | NEB | B9000S | |
| 免疫荧光染色 | Triton X-100 | Sigma | T8787 |
| STAR抗体 | Santa Cruz | sc-166821 | |
| DLK1抗体 | Proteintech | 10636-1-AP | |
| NOTCH3抗体 | Absin | abs116318 | |
| NOTCH2抗体 | Proteintech | KHC1062 | |
| CLDN5抗体 | Thermofisher | 4C3C2 | |
| IgG抗体 | Proteintech | CL488-10284 | |
| PDGFRA抗体 | Santa Cruz | sc-21789 | |
| DAPI | Beyotime | -- | |
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | Thermo Fisher | 11320 |
| 胎牛血清 | Hyclone | -- | |
| 青霉素和链霉素 | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000 | Invitrogen | -- |
| Opti-MEM培养基 | Thermo Fisher | 31985070 | |
| 原代颗粒细胞收集 | 胰蛋白酶-EDTA | Thermo Fisher | 25200056 |
| RT-qPCR | SuperScriptIII试剂盒 | -- | -- |
| Power SYBR Green PCR预混液 | -- | -- | |
| 设备 | DNBSEQ-T7测序仪 | BGI | -- |
| StepOne Plus | Applied Biosystems | -- | |
| Invitrogen Qubit 4.0 | Invitrogen | -- | |
| Agilent 4150 TapeStation | Agilent | -- | |
| 荧光显微镜 | Leica | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| snRNA-seq样本与分组 | 样本来源：12例人卵巢组织，年龄12-54岁；分组：青春期前12岁n=1，年轻23-29岁n=4，中年32-34岁n=2，老年42-54岁n=5；公共数据来源GSE202601 阅读提示：Methods 4.10及Results 2.1，Figure 1B，Table S1 |
| scStereo-seq空间转录组 | 样本：4例人卵巢组织（12、32、34、42岁）；bin大小：50（50×50 bins）；测序平台：DNBSEQ-T7；试剂盒：201ST114和201ST004 阅读提示：Methods 4.2和4.17，Figure 1A |
| 免疫荧光染色 | 抗体浓度：STAR 1:100，DLK1 1:100，NOTCH3 1:100，CLDN5 1:100，IgG 1:100，PDGFRA 1:50；切片厚度：8 μm；固定：4% PFA 10 min 阅读提示：Methods 4.4和4.5，Figure 6E,H |
| SVOG细胞DLK1过表达 | 细胞系：SVOG；质粒量：500 ng；转染试剂：Lipofectamine 3000 1.5 μL；孵育时间：48小时；检测：RT-qPCR 阅读提示：Methods 4.6、4.7和4.9，Figure 6I |
| 人原代颗粒细胞收集与分组 | 分组：健康年轻女性（<35岁）、健康老年女性（>40岁）、POI患者（<35岁）；来源：辅助生殖技术治疗后的卵丘-卵母细胞复合体；消化：0.05% Trypsin-EDTA 阅读提示：Methods 4.8，Figure 6J |
| 细胞互作分析 | 分析方法：Stereopy，cellphonedb数据库，statistical类型；DLK1:NOTCH3轴在各年龄组的互作数量 阅读提示：Methods 4.22，Figure 6A-C |
| SSS分析 | 衰老基因集来源：5个已发表基因集；SSS定义：年龄42岁卵巢中衰老敏感基因模块评分top 5%的spot（n=4509） 阅读提示：Methods 4.19，Figure 4D |