样本分组与组织处理
建立AD不同阶段和正常衰老的对比样本，并制备Stereo-seq芯片组织切片。
收集12例男性死后PFC（BA10）OCT包埋样本，根据Braak、CERAD和Aβ IHC分组；每例切取相邻切片No.1（H&E）、No.2（Stereo-seq）、No.3（Aβ IHC）。
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衰老与阿尔茨海默病前额叶皮层的Stereo-seq研究
Stereo-seq of the prefrontal cortex in aging and Alzheimer's disease.
实验完整度
高基于6例AD和6例对照人脑组织Stereo-seq空间转录组，结合IHC验证Aβ，并进行层特异性、单核及细胞通讯分析。
主要模型
6例男性AD患者死后前额叶皮层（BA10）组织 6例年龄匹配男性对照死后前额叶皮层组织
重点核对
AD组：Braak IV-VI期，CERAD C2-3；对照组：Braak II-III期，CERAD C0-1 根据Aβ免疫组化将AD分为中度（B01809C2）和重度（A02092E1、B02008C6） Stereo-seq区域：每例样本No.2切片10×10 mm区域 bin110分辨率层聚类：338,410个伪点，平均3150 counts和2225基因 bin50分辨率高应激Ex阈值：线粒体基因比例≥15%
摘要
衰老增加阿尔茨海默病（AD）风险，驱动淀粉样蛋白β（Aβ）积累、炎症和氧化应激等病理变化，尤其在前额叶皮层（PFC）。我们呈现了首个使用Stereo-seq生成的人前额叶皮层亚细胞分辨率空间转录组图谱，样本来自六例处于不同神经病理阶段的男性AD病例和六例年龄匹配的男性对照。我们的分析揭示了PFC各层中不同的转录改变，突出了层状结构的破坏，并暴露了AD相关的层间和细胞间相互作用变化。值得注意的是，我们识别出在应激神经元和附近胶质细胞中高度上调的基因，其中AD削弱了促进Aβ清除的应激反应相互作用。此外，细胞类型特异性共表达分析突出了三个分别与神经保护、蛋白去磷酸化和Aβ调控相关的神经元模块，且所有模块随AD进展而下调。我们识别出ZNF460作为调控这些模块的转录因子，提供了潜在的治疗靶点。总之，该空间转录组图谱为AD的分子机制提供了宝贵见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 衰老与AD如何在前额叶皮层中引起层状结构、细胞类型特异性转录及细胞间相互作用的改变，其分子机制是什么？
- 核心机制
- AD进展中，应激神经元和邻近胶质细胞的神经保护性配体-受体相互作用（如PSAP-GPR37L1、APP-CD74）减弱，导致Aβ清除和神经保护能力下降；三个神经元共表达模块（Ex1、Inh1、Inh2）随AD进展下调，ZNF460可能调控这些模块。
- 主要证据
- Stereo-seq空间转录组（bin110、bin50和单核分辨率）结合Aβ IHC，识别皮层分层结构破坏、层间谷氨酸能和NRXN信号减弱、高应激Ex比例增加，以及细胞通讯和共表达网络分析。
- 研究意义
- 提供了首个亚细胞分辨率的人PFC空间转录组图谱，为理解AD从正常衰老到进展期的分子机制提供见解，并提示ZNF460作为潜在治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
Stereo-seq空间转录组数据生成与层聚类
在bin110分辨率下识别PFC六层皮层和白质，并比较AD与NA的层比例和层特异性差异基因。
将原始矩阵转换为bin110伪点，用Harmony去批次，scc无监督聚类，DGE分析鉴定层标记基因；用Propeller比较层比例。
层间通讯网络分析
评估AD进展中层与层之间配体-受体相互作用的改变。
基于配体-受体数据库用CellChat构建层间通讯网络，比较NA、中度AD和重度AD的相互作用数量和强度。
高应激神经元定位与单核分辨率分析
在bin50和单核分辨率下识别高应激区域，并分析邻近细胞的转录反应。
将矩阵转换为bin50伪点，以线粒体基因比例≥15%定义高应激Ex；用深度学习模型分割细胞核，进行同心圆分析（level I-III）和细胞类型特异性DGE。
细胞间通讯与共表达网络分析
揭示AD中神经保护性细胞通讯的减弱及关键共表达模块和转录因子。
用CellChat比较level I和III的细胞通讯；用hdWGCNA构建Ex和Inh的共表达模块，GO富集和MotifScan鉴定转录因子。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
差异表达与比例分析
细胞通讯分析
单核分割与空间分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 组织包埋 | Tissue-Tek OCT包埋剂 | SAKURA FINETECK USA Inc. | 4583 |
| Stereo-seq芯片 | Stereo-seq透化芯片 | STOmics America Ltd | 210CP118 |
| 转录组学芯片 | STOmics America Ltd | 210CT114 | |
| 组织固定 | 甲醇 | Sigma | 34860 |
| 核酸染色 | 核酸染料 | Invitrogen | Q10212 |
| 洗涤 | 20X SSC缓冲液 | Ambion | AM9770 |
| 组织透化 | 透化缓冲液 | STOmics America Ltd | 111KP118 |
| cDNA释放 | 转录组学试剂盒 | STOmics America Ltd | 111KT114 |
| cDNA定量 | Qubit dsDNA HS检测试剂盒 | Invitrogen | Q32854 |
| 文库构建 | 文库构建试剂盒 | STOmics America Ltd | 111KL114 |
| 测序 | DNBSEQ-T7测序平台 | Complete Genomics | 100008555 |
| 免疫组化 | 磷酸化Tau（Ser202, Thr205）单克隆抗体（AT8） | Invitrogen | MN1020 |
| β淀粉样蛋白1-42多克隆抗体 | Invitrogen | 44-344 | |
| 酪胺信号放大试剂盒 | Invitrogen | B40915 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样本分组与病理分期 | AD组Braak IV-VI、CERAD C2-3；对照组Braak II-III、CERAD C0-1；根据Aβ IHC将AD分为中度和重度 阅读提示：Results 'The divergence of laminar structure...'第一段及Fig. 1A；Supplemental Data 1 |
| Stereo-seq切片与取样 | 每例样本取相邻切片No.1（H&E）、No.2（Stereo-seq 10×10 mm）、No.3（Aβ IHC）；切片厚度10 µm 阅读提示：Methods 'Tissue preparation, cryosection, stereo-seq library preparation, and sequencing' |
| bin110层聚类与层比例比较 | bin110伪点定义（110 bins×110 bins/spot）；scc聚类默认参数；层比例用Propeller比较 阅读提示：Methods 'Clustering analysis'和'DGE analysis'；Fig. 2A-B |
| 高应激神经元定义 | bin50伪点；线粒体基因比例阈值15%；过滤低于400基因的伪点 阅读提示：Results 'Identification of the location of brain segments under high stress...'及Fig. 4D |
| 单核同心圆分析 | 细胞核过滤阈值<150基因；level I ≤250 µm、level II 250-750 µm、level III 750-1250 µm 阅读提示：Methods 'Nucleus segmentation with nucleic acid staining'和'Concentric circles analysis' |
| 共表达网络构建 | hdWGCNA输入2000个高变基因；软阈值Ex=7、Inh=5；使用MetacellsByGroups默认参数（k=25, max_shared=10） 阅读提示：Methods 'Gene co-expression network analysis' |