奶牛胎盘发育的空间分辨转录组图谱分析

Spatially resolved transcriptomic profiling of placental development in dairy cow.

作者信息Guang-Hui Tan, Shi-Jie Liu, Ming-Le Dou, De-Feng Zhao, Ao Zhang, Heng-Kuan Li, Fu-Nong Luo, Tao Shi, Hao-Ping Wang, Jing-Yuan Lei, Yong Zhang, Yu Jiang, Yi Zheng, Fei Wang
PMID38766743
期刊Zool Res
发布时间2024-05-18
DOI10.24272/j.issn.2095-8137.2023.205

实验完整度

高

包含空间转录组测序、免疫组化验证及生物信息学分析,两个独立证据层级。

主要模型

荷斯坦奶牛妊娠90天胎盘组织 荷斯坦奶牛妊娠130天胎盘组织

重点核对

妊娠阶段:90天和130天,各取一个样本 物种与品种:健康荷斯坦奶牛 组织处理:胎盘子叶及周围组织,包含母体和胎儿组织,用DPBS清洗,OCT包埋,10μm冷冻切片 Stereo-seq分析单元:Bin 100(100×100 DNB),共71,899个Bins 免疫组化抗体:YBX1 Rabbit mAb (A3534, 1:100) 和 NPAS2 Rabbit pAb (A16930, 1:100)

摘要

胎盘在哺乳动物成功繁殖中起关键作用。反刍动物具有半侵入性胎盘,其特征是由母体子宫内膜肉阜和胎儿胎盘子叶形成的高度血管化结构,对足月胎儿发育至关重要。奶牛胎盘至少包含两种滋养层细胞群:单核细胞(UNC)和双核细胞(BNC)。然而,由于难以阐明胎盘自然环境的转录组动态,对滋养层细胞与微环境之间的分子和细胞相互作用,以及调控滋养层细胞分化和功能化的分子机制了解甚少。为填补这一知识空白,我们采用Stereo-seq在妊娠90天和130天的奶牛胎盘中以接近单细胞分辨率绘制空间基因表达模式,获得了高分辨率、空间分辨的基因表达谱。基于聚类和细胞标记基因表达分析,关键转录因子YBX1和NPAS2被证明调控滋养层细胞亚群的异质性。细胞通讯和轨迹分析为理解胎盘微环境中细胞间相互作用及滋养层细胞向BNC分化提供了框架。细胞轨迹差异分析鉴定了一组参与调控滋养层细胞分化的基因。此外,还鉴定了有助于形成特定组织结构的空间模块和共变基因。总之,这些发现为奶牛胎盘发育和功能相关的关键生物学通路提供了基础性见解。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
奶牛胎盘发育过程中滋养层细胞的转录组动态、细胞异质性、细胞间相互作用及分化机制如何?
核心机制
转录因子YBX1和NPAS2调控滋养层细胞亚群异质性及妊娠相关蛋白(PAGs和PRPs)的分泌;UNCs通过两个 distinct 转变分化为BNCs,伴随SOD1、NPPC、LGALS3、PRP1、FTH1、CSH2和PAG17表达升高及IGF2表达降低。
主要证据
Stereo-seq空间转录组图谱鉴定10种主要细胞类型及7个UNC亚群;CellChat分析揭示UNCs和BNCs具有最强信号输出;Monocle3轨迹分析描绘UNC向BNC分化路径;免疫组化验证YBX1和NPAS2在UNC中的表达定位。
研究意义
为推进对反刍动物胎盘发育、功能和分子调控的理解提供了全面框架和资源,对奶牛育种和繁殖策略具有潜在长期益处。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

胎盘组织采集与冷冻切片

获取妊娠90天和130天奶牛胎盘组织,用于空间转录组分析

从两头荷斯坦奶牛分别采集妊娠90天和130天的胎盘组织,包含子叶/胎盘块及邻近区域,用DPBS清洗,OCT包埋,切成10μm冷冻切片。

2

Stereo-seq文库构建与测序

在空间上捕获胎盘组织的基因表达

将组织切片贴附于Stereo-seq芯片,固定、染色、成像、透化,构建文库,并在MGI DNBSEQ-Tx测序仪上测序。

3

空间转录组数据聚类与细胞类型鉴定

鉴定胎盘细胞类型及其空间分布

使用Seurat进行降维聚类(Bin 100),鉴定16个聚类,根据标记基因注释为10种主要细胞类型,并用Souporcell区分母体和胎儿来源。

4

UNC亚群分析及转录因子调控网络

解析UNC异质性及关键转录因子

对UNC进行亚群分析,鉴定7个亚群,使用GENIE3构建转录因子调控网络,并通过免疫组化验证YBX1和NPAS2的表达。

5

细胞通讯与分化轨迹分析

揭示胎盘微环境细胞间通讯及滋养层分化路径

使用CellChat分析配体-受体相互作用,Monocle3进行拟时序轨迹分析。

6

空间基因模块识别

鉴定空间共变基因模块及其功能

使用Hotspot识别空间自相关基因模块(EG 16个,MG 15个),进行GO富集和PPI网络分析。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
Leica CM1950冷冻切片机Leica--
核酸染色试剂Thermo FisherQ10212
Ti-7 Nikon Eclipse显微镜Nikon--
VAHTS DNA纯化磁珠VazymeN411
MGI DNBSEQ-Tx测序仪MGI--
YB-1/YBX1兔单克隆抗体--A3534
NPAS2兔多克隆抗体--A16930

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
胎盘组织采集
妊娠阶段(90天和130天)、样本量(每个阶段1个)、品种(荷斯坦奶牛)
阅读提示:Methods: Tissue collection and cryopreservation
Stereo-seq文库构建
芯片类型、透化时间(37°C 5分钟)、测序平台及读长
阅读提示:Methods: Stereo-seq library preparation and sequencing
数据分析参数
聚类分辨率(0.5)、k值(30)、可变基因数(3000)、Bin大小(100)
阅读提示:Methods: Stereo-seq data processing, integration, and visualization
免疫组化
抗体稀释比(1:100)、抗原修复方法、一抗孵育条件(4°C过夜)
阅读提示:Methods: Immunohistochemistry