数据准备与空间配准
将不同分辨率的空间代谢组学与转录组学数据对齐至共同像素坐标。
输入经外部工具预处理的特征–像素矩阵或Seurat对象；将高分辨率转录组数据分箱以匹配较低分辨率代谢组数据；使用RNiftyReg模块进行线性或非线性变换配准，或使用SpatialData外部配准后导入。
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SMIntegration：一个用于全面空间代谢组学与转录组学整合分析及可视化的网络工具
SMIntegration: A web tool for comprehensive spatial metabolomics and transcriptomics integrated analysis and visualization.
实验完整度
高使用Stereo-seq转录组与AFADESI-MS代谢组小鼠脑数据，含空间配准、聚类、差异分析、基因–代谢物网络和功能注释多层验证
主要模型
7周龄雄性小鼠脑冠状切片（Stereo-seq空间转录组） AFADESI-MS空间代谢组学数据（50 μm分辨率）
重点核对
空间代谢组数据经Cardinal处理，SManalyst单同位素质量匹配注释，获得13,707像素和560个注释质量特征，属Level 3注释 空间转录组Stereo-seq数据分箱至50 μm，获得14,605像素和10,000个高变基因 两模态经SpatialData配准后行KNN插值与过滤，得到14,530个有效像素 差异分析将每个像素视为独立样本，用Seurat FindMarkers及Wilcoxon秩和检验，Bonferroni校正，默认|log2FC|>0.26且校正P<0.05 基因–代谢物网络用像素级Spearman相关，保留校正P<0.01且|r|>0.6的边
摘要
当前空间组学分析工具在整合转录组学与代谢组学分析、深入生物学解释以及用户友好操作方面常面临挑战。为此，我们开发了SMIntegration，这是首个专为空间代谢组学与转录组学整合分析设计的基于网络的图形化平台。该平台使用R/Shiny构建并采用Docker容器化部署，提供从预处理空间特征到功能注释的完整整合工作流程。其核心功能包括：（1）自动化与交互式空间配准；（2）跨模态空间模式识别；（3）基于聚类结果、用户定义区域或细胞类型注释的基因与质量特征灵活差异分析；以及（4）组特异性基因–代谢物网络构建与交互式可视化。以相邻小鼠脑冠状切片（Stereo-seq转录组学与AFADESI-MS代谢组学）为例，SMIntegration成功识别出单模态聚类遗漏的导水管周围灰质和下连合器官。细胞类型分析揭示了星形胶质细胞富集的GABA代谢与Slc6a11之间的关联，而海马角区域与中脑导水管周围灰质的比较剖析了谷氨酸能与内源性大麻素信号通路模块。凭借零代码界面，SMIntegration使广泛的研究人员能够深入探索发育、稳态和疾病过程中微环境内的基因–代谢物相互作用机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何构建一个用户友好、可深度整合空间转录组学与空间代谢组学数据并进行生物学解释与可视化的分析平台。
- 核心机制
- 通过像素坐标对齐整合两模态特征矩阵，实现联合降维聚类、跨模态空间模式相关分析及组特异性基因–代谢物相关网络构建，从而揭示空间共定位的分子模块。
- 主要证据
- 以相邻小鼠脑冠状切片Stereo-seq与AFADESI-MS数据验证，联合聚类同时识别出单模态遗漏的导水管周围灰质和下连合器官；细胞类型分析显示星形胶质细胞富集区GABA与Slc6a11共注释于GABA能突触通路；CA与PAG比较剖析谷氨酸能及内源性大麻素信号通路模块。
- 研究意义
- 提供零代码界面，使广泛研究人员能够深入探索发育、稳态和疾病过程中微环境内的基因–代谢物相互作用机制，并推动空间多组学研究。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
空间表达模式识别
识别跨组学空间变异特征并量化基因与代谢物模块间的空间相关性。
应用SpaGene基于空间坐标构建k-NN图识别高表达子网络，以EMDg量化空间模式强度并经随机置换检验；用NMF将显著特征划分为空间模块；用Moran's I评估基因与代谢物模块分布模式一致性。
像素级空间聚类
通过整合两模态数据进行联合降维聚类以识别同步空间域。
提供Louvain、LM、SLM、PCA后k-means及UMAP后k-means五种聚类方法；预处理包括TIC或RMS归一化、LogNormalize变换及选取前2,000个基因/质量特征；按像素坐标拼接两模态标准化矩阵进行联合聚类。
细胞类型注释与迁移
将转录组细胞类型标签转移至空间对齐的代谢组像素以定义细胞类型特异ROI。
使用SingleR基于MouseRNAseqData和HumanPrimaryCellAtlasData参考数据集注释转录组细胞类型，再按重叠空间坐标将标签迁移至代谢组像素；也支持上传自定义注释。
差异分析
在选定ROI间鉴定差异表达基因与差异丰度质量特征。
通过交互式绘制、基于聚类或基于细胞类型三种方式定义ROI并指定比较组；每个像素作为独立样本，用Seurat FindMarkers及Wilcoxon秩和检验鉴定DEG和DAM，Bonferroni校正。
组特异性基因–代谢物网络构建
揭示特定生物学条件下DEG与DAM的空间共表达关系。
对每个比较组选取差异基因与质量特征，用像素级数据计算Spearman相关系数，保留满足阈值的配对作为网络边，并在组间保持相同节点布局以便比较。
功能关联与注释
解释DEG与DAM的生物学功能并量化通路共注释。
进行KEGG通路映射并统计共注释到各通路的DEG和DAM数量，排除过于宽泛的全局通路，通路节点按上下调着色并可查看空间分布。
小鼠脑数据验证
在真实空间多组学数据上验证平台识别精细结构与分子网络的能力。
使用相邻小鼠脑冠状切片Stereo-seq转录组与AFADESI-MS代谢组数据，经配准、联合聚类、细胞类型差异分析和区域比较，识别PAG、SCO及GABA/谷氨酸相关通路。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 软件实现与部署 | R语言 | -- | v4.4.2 |
| Docker容器 | -- | -- | |
| 空间配准 | RNiftyReg配准包 | -- | 2.8.4 |
| 空间代谢组数据处理 | Cardinal软件包 | -- | -- |
| 代谢物注释 | SManalyst平台 | -- | -- |
| 细胞类型注释 | 小鼠RNAseq参考数据集 | -- | -- |
| 人类原代细胞图谱参考数据集 | -- | -- | |
| 空间配准 | SpatialData框架 | -- | -- |
| 脑图谱配准 | DeepSlice工具 | -- | -- |
| QuickNII工具 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 数据准备与空间配准 | 转录组分箱比例（500 nm分箱100倍至50 μm）、输入格式、配准变换类型 阅读提示：Methods中Data preparation and spatial registration小节及Supplementary Fig. S2、S13 |
| 空间表达模式识别 | k-NN图构建参数、EMDg置换检验参数、NMF模块数 阅读提示：Methods中Spatial expression pattern recognition小节 |
| 像素级空间聚类 | 聚类方法选择、归一化方式（TIC或RMS）、前2,000特征选择、聚类数 阅读提示：Methods中Pixel-level spatial clustering小节及Supplementary File 2 |
| 差异分析 | ROI定义方式、比较分组、|log2FC|>0.26与校正P<0.05阈值 阅读提示：Methods中Differential analysis小节及Supplementary Fig. S7、S8 |
| 基因–代谢物网络 | Spearman相关阈值（校正P<0.01、|r|>0.6）、比较组 阅读提示：Methods中Group-specific network construction小节及Supplementary Fig. S9 |
| 小鼠脑数据验证 | 7周龄雄性小鼠、AFADESI-MS 50 μm、Stereo-seq分箱、14,530有效像素、Level 3代谢物注释 阅读提示：Methods中Example data and validation小节及Supplementary Fig. S13 |