类器官培养与体内参考组织获取
建立多种类器官模型及体内参考组织,用于空间转录组比较分析。
按照已发表的定向分化方案生成8种人iPSC来源类器官(脑、肺、造血、Transwell肾、悬浮肾、心脏瓣膜、软骨、心肌),并获取E13.5小鼠头和21 PCW小鼠心脏作为体内参考组织。
Application of spatial transcriptomics across organoids for a high-resolution, spatial whole-transcriptome benchmarking dataset.
涵盖8种类器官模型和2种体内参考组织的空间转录组测序,包含方案优化、多样本芯片放置、区域差异表达分析和功能基因集富集验证。
人诱导多能干细胞来源的脑类器官 人诱导多能干细胞来源的Transwell肾类器官 人诱导多能干细胞来源的软骨类器官 人诱导多能干细胞来源的心肌类器官
组织透化时间:肺/造血/Transwell肾/悬浮肾/软骨12分钟,鼠头和脑类器官15分钟,心脏类器官和工程化心脏瓣膜18分钟,鼠心24分钟 心肌类器官分组:6个血清-free对照和6个定向成熟(DM)类器官共12个置于同一芯片 脑类器官培养至第31天收集,软骨类器官培养至第62天收集 脑、软骨和Transwell肾类器官以同芯片上的多个类器官作为伪重复进行区域间差异表达分析 RNA捕获效率通过每细胞bin的UMI数和基因数、映射唯一reads数及测序饱和度评估
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
建立多种类器官模型及体内参考组织,用于空间转录组比较分析。
按照已发表的定向分化方案生成8种人iPSC来源类器官(脑、肺、造血、Transwell肾、悬浮肾、心脏瓣膜、软骨、心肌),并获取E13.5小鼠头和21 PCW小鼠心脏作为体内参考组织。
改善类器官组织在Stereo-seq芯片上的黏附,减少组织脱落。
对心肌、心脏瓣膜和软骨类器官的切片使用poly-L-lysine包被的Stereo-seq T-chip以增强黏附;其余样本按STOmics标准流程贴片。
优化组织透化条件以限制转录本扩散并实现准确的空间基因表达谱分析。
切片经冰甲醇固定后进行组织透化,使用STOmics转录组试剂盒和文库构建试剂盒构建cDNA文库,并在MGI DNBSEQ T7测序仪上测序。
评估Stereo-seq平台在多种类器官和体内参考组织中的RNA捕获质量。
使用ImageStudio v2.1.1处理ssDNA免疫荧光图像,SAW v6.12流程进行比对和细胞分箱,Stereopy和Squidpy计算每细胞bin的UMI数和基因数、映射reads数、DNA纳米球数和测序饱和度等指标。
探究增大方形bin大小对RNA捕获、基因数和生物信号的影响。
将方形bin大小从50增至75和100(分别对应25、37.5和50 μm2),使用定制过滤参数去除背景信号,比较体内参考组织和脑、软骨类器官的组织覆盖面积、bin数量和每bin基因数分布。
开发替代细胞聚类和分类的区域分析流程,识别类器官核心与边界区域的差异表达基因和生物学过程。
对脑、Transwell肾和软骨类器官去除边缘离群点后,基于到凸包边界的距离将bin分类为边缘、边界和核心区域,使用伪批量策略进行核心与边界区域的差异表达分析和GSEA。
将区域分析方法扩展至不规则形状的心肌类器官,比较血清-free对照和DM培养条件之间的转录差异。
对心肌类器官计算凸包边界,排除边界距离最低15百分位的bin后对剩余bin进行PCA,将PC1作为长轴将组织分为两极和中心区域,比较对照和DM类器官中心区域的差异表达基因和GSEA。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 组织包埋 | OCT包埋剂 | SAKURA | 4583 |
| 细胞培养 | Matrigel基质胶 | Corning | 354277 |
| Geltrex无LDEV还原生长因子基底膜基质 | Thermo Fisher Scientific | A1413301 | |
| Essential 8培养基 | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | |
| StemFlex培养基 | Thermo Fisher Scientific | A3349401 | |
| mTESR1培养基 | Stem Cell Technologies | 85857 | |
| 芯片包被 | 多聚-L-赖氨酸 | Sigma Aldrich | P8920 |
| 软骨类器官处理 | 三碘甲状腺原氨酸 | Sigma Aldrich | T6397 |
| 空间转录组文库构建 | STOmics转录组试剂盒 | STOmics | 111KT114 |
| STOmics文库构建试剂盒 | STOmics | 111KL114 | |
| cDNA文库质控 | D1000 Tapestation试剂 | Agilent Technologies | 5067-5602 |
| Screentape | Agilent Technologies | 5067-5582 | |
| cDNA浓度测定 | Qubit dsDNA HS试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | Q33231 |
| 冷冻切片 | CM3050S冷冻切片机 | Leica | -- |
| 测序 | MGI DNBSEQ T7测序仪 | MGI | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 类器官培养与收集时间 | 各类型类器官的培养基、分化天数及收集时间点 阅读提示:STAR Methods中Organoids generation小节 |
| 芯片包被与组织贴片 | poly-L-lysine浓度、孵育时间、每芯片放置的类器官数量及包埋方式 阅读提示:STAR Methods中Stereo-seq T-chip coating小节及Figure 1A |
| 组织透化 | 各组织类型的透化时间 阅读提示:STAR Methods中Sample processing and library preparation小节 |
| 区域特异性分析 | 离群点检测k值、Z-score阈值、边缘/边界/核心区域划分百分位及伪重复设置 阅读提示:STAR Methods中Organoid-specific regional analysis小节及Figure 3 |
| 心肌类器官条件比较 | 对照与DM培养条件、每组类器官数量、中心区域划分方法及差异表达分析设计 阅读提示:STAR Methods中Organoid-specific regional analysis小节及Figure 4 |