原代肝细胞分离与Stereo-cell上样
获得高活力单肝细胞并实现芯片上均匀分布以进行空间分辨单细胞测序。
采用改良两步胶原酶灌注法分离C57BL/6 8周龄小鼠原代肝细胞，经滤网过滤、50% Percoll纯化后加载到Stereo芯片，固定、DAPI染色并同步明场与DAPI成像。
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Stereo-cell解码多倍体肝细胞的空间与功能异质性
Stereo-cell deciphers the spatial and functional heterogeneity of polyploid hepatocytes.
实验完整度
高含Stereo-cell单细胞转录组、肝组织切片免疫荧光、FACS分选及核面积成像，多体系交叉验证倍性分类
主要模型
C57BL/6小鼠8周龄原代肝细胞 Stereo-chip上的单细胞悬液 P56 C57BL/6小鼠肝冷冻切片 FACS分选的2c/4c/8c肝细胞
重点核对
C57BL/6小鼠8周龄（P56）雄性来源原代肝细胞，经两步胶原酶灌注分离，活力>96% 2个生物学重复芯片hep56_H8与hep56_M1，加载7,721个细胞，质控后4,888个细胞，捕获率68.5% 核面积经StarDist分割后k-means聚类分为二倍体、四倍体、八倍体核，每细胞保留1或2个核 FACS以2 µg/ml DAPI 4°C避光染色20 min，分选2c、4c、8c群用于核面积与荧光强度相关分析 组织切片免疫荧光每组3只生物学独立小鼠，每只随机3个视野
摘要
肝脏的一个显著特征是存在大量多倍体肝细胞。然而，二倍体、四倍体和八倍体肝细胞之间的功能差异仍知之甚少。在本研究中，我们采用空间分辨单细胞测序技术Stereo-cell，解析不同肝细胞倍性亚型之间的转录组和功能异质性。我们详细介绍了Stereo-cell基于成像的倍性鉴定（SCIPI）的开发，这是一条整合明场细胞轮廓识别、基于DAPI的核面积与核数量定量以及UMI条形码单细胞转录组学的技术流程。该方法能够精确鉴定6种核心肝细胞亚型：单核二倍体（2n×1）、单核四倍体（4n×1）、双核四倍体（2n×2）、单核八倍体（8n×1）、双核八倍体（4n×2）和双核十六倍体（8n×2）肝细胞。基于倍性注释的单细胞转录组分析显示，基因表达水平随倍性和核数量增加而升高。代谢通路相关基因在多倍体细胞中显著上调，提示细胞多倍化增强了肝细胞的代谢活性。此外，该SCIPI策略广泛适用于各种多倍体组织的研究，为跨多种生物学研究的创新性倍性分辨研究提供了新颖而通用的框架。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 二倍体、四倍体和八倍体等多倍体肝细胞亚型之间存在怎样的转录组与功能异质性，以及如何在同一细胞内同时获得倍性信息与转录组信息。
- 核心机制
- 肝细胞倍性与核数量增加伴随基因表达水平升高，多倍体细胞中代谢通路相关基因显著上调，提示细胞多倍化增强肝细胞代谢活性。
- 主要证据
- 利用SCIPI在Stereo-cell平台上鉴定6种肝细胞倍性亚型并解析其转录组；与肝组织切片免疫荧光及FACS倍性比例一致；FACS分选细胞核面积与DAPI荧光强度高度相关；差异表达与GO富集显示八倍体上调代谢相关基因。
- 研究意义
- SCIPI为肝脏多倍体在肝再生、发育及多种肝病中的调控机制研究提供新技术途径，并可推广至心肌细胞、骨骼肌纤维等多倍体组织的倍性分辨研究。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
图像配准与细胞/细胞核分割
将DAPI核信息与UMI转录组信息对齐，为倍性判定提供细胞和核边界。
用FIJI ImageJ将DAPI图像配准至UMI图像；明场用Cellpose cyto3模型分割细胞，DAPI用StarDist 2D_versatile_fluo模型生成核掩膜。
基于核面积的倍性分类
在同一细胞内区分单核/双核及二倍体、四倍体、八倍体核，确定6种倍性亚型。
对StarDist分割的核按核面积进行k-means聚类，赋予倍性标签，再结合每细胞核数确定倍性亚型。
倍性比例与SCIPI准确性验证
验证SCIPI倍性分类与组织切片及FACS结果的一致性。
对P56小鼠肝冷冻切片进行β-Catenin与DAPI免疫荧光并用相同策略判定倍性；FACS分析DNA含量并分选2c、4c、8c细胞测量核面积与DAPI荧光强度。
倍性分辨转录组与空间定位分析
解析不同倍性亚型的差异表达、代谢通路富集及肝小叶带化分布。
比较四倍体vs二倍体、八倍体vs二倍体及二倍体vs多倍体的差异表达基因，GO富集分析，并基于Cyp2e1/Cyp2f2等带化基因计算CV–PV带化评分。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 肝细胞分离灌注 | 无钙HBSS | Gibco | 14175–095 |
| 肝细胞消化 | IV型胶原酶 | Sigma | C5138-5 G |
| 氯化钙 | Sigma | 793639–500 G | |
| 肝细胞分离 | Dulbecco改良Eagle培养基 | Cytiva | SH30243.01 |
| 肝细胞纯化 | Percoll溶液 | Sigma | P7828-500ML |
| 肝细胞重悬 | Dulbecco磷酸盐缓冲液 | Sigma | D8537-500ML |
| 牛血清白蛋白 | Aladdin | A116563-25 g | |
| Stereo-chip预处理 | Stereo-seq时空单细胞转录组试剂盒 | STOmics | STC1000R |
| Stereo-seq时空单细胞条形码扩增试剂盒 | STOmics | STC1000P | |
| 细胞核染色 | DAPI溶液 | Thermo | 62248 |
| 成像 | Motic PA53 FS6显微镜 | Motic | -- |
| 文库定量 | Qubit双链DNA检测试剂盒 | Thermo | Q32854 |
| 文库检测 | Agilent 2100生物分析仪 | Agilent | -- |
| 测序 | MGI DNBSEQ-Tx测序平台 | MGI | -- |
| 免疫荧光染色 | BeyoTSA™三标四色多重荧光染色试剂盒 | Beyotime | P1351S |
| β-Catenin抗体 | Cell Signaling | 9582 | |
| 流式分析 | 磷酸盐缓冲液 | Gibco | 10010001 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 原代肝细胞分离 | 小鼠品系、周龄、性别（C57BL/6 8周龄雄性）；胶原酶IV浓度0.1 mg/ml；Percoll浓度50%；细胞活力需>96%；分离后≤1 h内上样 阅读提示：Methods“Hepatocytes isolation and preparation” |
| Stereo-cell上样与成像 | 每芯片上样细胞数及总加载细胞数（7,721）；2个生物学重复（hep56_H8、hep56_M1）；poly-l-lysine浓度0.01%；固定条件冰甲醇−20°C 30 min；DAPI染色 阅读提示：Methods“Stereo chip preprocessing for hepatocyte loading and microimaging”及Supplementary Fig. S1a |
| 倍性与细胞分割判定 | StarDist与Cellpose模型选择；核掩膜≥50%面积归属规则；k-means核面积聚类；仅保留1或2核细胞；每区域误判<3细胞 阅读提示：Methods“Cell segmentation and ploidy analysis”与Results“Ploidy identification workflow and accuracy assessment” |
| 组织切片免疫荧光验证 | β-Catenin抗体稀释比例文中未明确说明；每组3只小鼠、每只3个随机视野；与Stereo-cell相同的分割与倍性判定流程 阅读提示：Methods“Immunohistochemistry and analysis”与Figure 3e–g |
| FACS倍性验证 | DAPI浓度2 µg/ml、4°C避光20 min；乙醇固定终浓度75%；分选2c/4c/8c群；分选二倍体群中约13%双核细胞污染 阅读提示：Methods“Flow cytometry and analysis”与Supplementary Fig. S1g |
| 差异表达与带化分析 | DEG阈值adj_p_val<0.05且avg_log2FC>0；CV与PV模块基因列表；带化评分分20 bins；十六倍体被排除 阅读提示：Methods“Pseudotime analysis of hepatic zonation”与Figure 5a–i |