尾部发育与再生中Pax7+细胞命运追踪
确定Pax7+细胞在尾部发育和再生中是否贡献于肌肉以外的谱系。
构建dTG-Pax7美西螈，他莫昔芬诱导后追踪CHERRY+细胞在尾部发育（14天、6.5个月）和再生（截肢后30天）中的分布，并用免疫组化鉴定谱系标志物。
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不同的干细胞机制主导美西螈初级体轴与附肢的再生
Divergent stem cell mechanisms govern the primary body axis and appendage regeneration in the axolotl.
实验完整度
高包含遗传谱系追踪、单细胞移植、scRNA-seq、空间转录组及TGF-β通路功能验证（药物抑制与遗传过表达）
主要模型
Pax7:ERT2CreERT2/CAG:GFP-STOP-Cherry双转基因美西螈（dTG-Pax7） Myf5:ERT2CreERT2/CAG:DeadGFP-STOP-Cherry双转基因美西螈（dTG-Myf5） 单细胞移植模型（d/d宿主） NIH3T3细胞系
重点核对
他莫昔芬诱导剂量与方案：幼体2.5cm美西螈3 μM他莫昔芬浸泡两次，间隔1天；胚胎0.5-1 μM单次12-24小时或连续处理 截肢位置：泄殖腔后第12肌节处（单细胞移植实验在移植细胞后方500 μm内截肢） 药物处理：SB-431542（25 μM）、IWR-1（25 μM）、U0126（40 μM）于截肢后3天开始，每日更换 遗传操作：Pax7+细胞中过表达caTgfbr1或Smad7，他莫昔芬诱导后追踪 检测终点：尾部再生30天（谱系追踪）、21天（遗传操作）、26天（药物处理）
摘要
探索器官再生的基本机制对于推进再生医学至关重要。美西螈尾部为研究包括分节肌肉、椎骨和皮肤在内的初级体轴再生提供了机会。在尾部发育过程中，肌肉干细胞（MuSCs）显示出预期的肌肉谱系特异性。然而，尾部截肢诱导了MuSC潜能扩展，使其克隆性贡献于肌肉、包括软骨在内的结缔组织、周细胞和成纤维细胞。这种扩展的潜能未在肢体再生中观察到，交叉移植实验表明这些潜能差异可能是由内在因素决定的。单细胞RNA测序分析揭示，尾部MuSCs回复到类似胚胎中胚层的状态。通过基因操作（在MuSCs中过表达组成性激活的转化生长因子-β（TGF-β）受体或Smad7（TGF-β信号拮抗剂）），我们证明TGF-β信号水平分别决定MuSCs向结缔组织谱系或肌肉谱系分化的命运。我们的发现表明，MuSCs的差异可能代表了初级体轴再生与附肢再生之间的根本区别。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 美西螈尾部（初级体轴）与肢体（附肢）再生是否采用相同的干细胞机制，以及尾部MuSCs在再生中是否具有多能性及其调控机制。
- 核心机制
- 尾部MuSCs在再生过程中经TGF-β信号调控回复至胚胎中胚层样多能状态，高TGF-β活性驱动其向结缔组织（成纤维细胞、周细胞、软骨）分化，低TGF-β活性促进肌肉分化。
- 主要证据
- 遗传谱系追踪显示Pax7+和Myf5+ MuSCs在尾部再生中贡献于肌肉和结缔组织；单细胞移植证明单个尾部MuSC具有多谱系潜能而肢体MuSC为单能；scRNA-seq和RNA velocity揭示MuSCs经中间细胞（IM）向结缔组织分化；SB-431542抑制TGF-β减少成纤维细胞产生，过表达caTgfbr1或Smad7分别转向结缔组织或肌肉命运。
- 研究意义
- MuSCs的分化潜能和谱系变异可能代表美西螈初级体轴与附肢再生之间的根本区别，并可能延伸至其他脊椎动物；探索调控该变异的机制可为再生医学策略开发提供更深理解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
Myf5+肌源性干/祖细胞命运追踪
精确确定尾部再生中结缔组织谱系的来源细胞。
构建dTG-Myf5美西螈，他莫昔芬诱导后追踪CHERRY+细胞在未损伤和截肢后尾部再生中的命运。
单细胞移植分析MuSC异质性与多能性
在克隆水平验证单个尾部MuSC是否具有多谱系分化潜能。
从dTG-Pax7美西螈尾部肌肉分离CHERRY+单细胞，移植到d/d宿主尾部，截肢后追踪单个细胞在再生中的后代。
肢体与尾部MuSC交叉移植
确定MuSC潜能差异是内在决定还是环境决定。
将肢体MuSC移植到尾部、尾部MuSC移植到肢体，追踪再生中的后代。
scRNA-seq与RNA velocity分析再生中MuSC状态转变
揭示MuSCs向结缔组织谱系分化的中间状态和转录轨迹。
FACS分选未损伤和再生尾部CHERRY+细胞，进行Smart-seq2单细胞测序，分析细胞聚类、干性评分、RNA velocity和轨迹推断，并进行Stereo-seq空间转录组分析胚胎EPrCs定位。
TGF-β通路药物抑制与遗传操作验证
验证TGF-β信号在MuSC命运决定中的作用。
使用SB-431542抑制TGF-β，IWR-1抑制Wnt，U0126抑制MAPK，追踪CHERRY+细胞命运；构建dTG-caTgfbr1和dTG-Smad7美西螈，在Pax7+细胞中过表达caTgfbr1或Smad7，追踪尾部再生中的细胞命运；Western blot检测p-SMAD2。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物麻醉 | 苯佐卡因 | Sigma-Aldrich | E1501-500G |
| 他莫昔芬诱导 | 他莫昔芬（4-OHT） | Sigma-Aldrich | H7904 |
| 他莫昔芬溶解 | 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | D8418 |
| TGF-β通路抑制 | SB-431542 | MedChemExpress | HY-10431 |
| Wnt通路抑制 | IWR-1 | MedChemExpress | HY-12238 |
| MAPK通路抑制 | U0126 | MedChemExpress | HY-12031 |
| 单细胞移植 | 胶原酶 | Sigma-Aldrich | C7657-25MG |
| 拉制毛细管 | Sutter | BF120-69-10 | |
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基 | Gibco | C11995500BT |
| 胎牛血清 | Hyclone | SH30396.03 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140-122 | |
| 0.25%胰蛋白酶 | Gibco | 25200-072 | |
| 细胞转染 | 脂质体转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | L3000-015 |
| Western blot | 商品化裂解缓冲液 | Affinibody | AIWB-012 |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Vazyme | E112-01 | |
| 聚偏二氟乙烯膜 | Immobilon | IPVH00010 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | V90933 | |
| 兔抗p-SMAD2抗体 | CST | 18338 T | |
| 兔抗SMAD2抗体 | CST | 5339 T | |
| 小鼠抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶抗体 | Sigma-Aldrich | G8795 | |
| 大鼠抗小鼠辣根过氧化物酶抗体 | the Jackson ImmunoResearch | 115-035-068 | |
| 驴抗兔辣根过氧化物酶抗体 | the Jackson ImmunoResearch | 711-035-152 | |
| NcmECL Ultra化学发光试剂盒 | Ncmbio | P10100 | |
| Touch Imager成像仪 | E-BLOT | -- | |
| 免疫荧光 | 小鼠抗TUJ1抗体 | R&D | MAB1195 |
| 兔抗CD34抗体 | Abcam | ab81289 | |
| 兔抗MEF2C抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-313 | |
| 兔抗SOX2抗体 | GeneTex | GTX124477 | |
| 兔抗PRRX1抗体 | -- | -- | |
| 兔抗SOX10抗体 | Abcam | ab264405 | |
| 小鼠抗PAX7抗体 | DSHB | -- | |
| 大鼠抗CHERRY抗体 | Invitrogen | M11217 | |
| 兔抗SOX9抗体 | Merck | AB5535 | |
| 兔抗层粘连蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| 小鼠抗MHC抗体（FITC偶联） | DSHB | -- | |
| 兔抗p-SMAD2抗体 | CST | 18338 T | |
| Cy3标记驴抗大鼠免疫球蛋白G | the Jackson ImmunoResearch | 712-165-153 | |
| Cy5标记山羊抗兔免疫球蛋白G | Thermo Fisher Scientific | A10523 | |
| Alexa Fluor 647标记驴抗小鼠免疫球蛋白G | the Jackson ImmunoResearch | 715-606-150 | |
| 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚 | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| 抗淬灭封片剂 | Bio-Rad | BUF058C | |
| 原位杂交 | BM purple底物 | Roche | 11442074001 |
| T7 RNA聚合酶体外转录试剂盒 | NEB | M0251L | |
| 柠檬酸钠缓冲液 | Sangon | B548110-0200 | |
| 核糖核酸酶A | Sigma-Aldrich | R4642 | |
| 免疫荧光 | 柠檬酸抗原修复液 | Sangon | E673001-0100 |
| 驴血清 | Solarbio | ASL050 | |
| 抗体稀释液 | Genefist | GF1600-1 | |
| 切片 | OCT包埋剂 | Sakura | 4583 |
| scRNA-seq | Liberase | -- | -- |
| 脱氧核糖核酸酶I | -- | -- | |
| MACS 70微米细胞滤器 | Miltenyi Biotec | 130-098-462 | |
| Nonidet P40替代物 | Roche | 11332473001 | |
| Illumina NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- | |
| 空间转录组 | Qubit单链DNA试剂 | Invitrogen | Q10212 |
| 胃蛋白酶 | Sigma-Aldrich | P7000 | |
| MGI DNBSEQ-T10测序仪 | MGI | -- | |
| 分子克隆 | In-fusion克隆试剂盒 | Vazyme | C115-01 |
| 高保真DNA聚合酶 | Vazyme | P515-03 | |
| 转基因构建 | CAS9蛋白 | Editgene | EDE0008-C5 |
| BFP-nls片段 | Genscript | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 他莫昔芬诱导谱系追踪 | 幼体2.5 cm美西螈他莫昔芬浓度3 μM、浸泡两次间隔1天；胚胎0.5-1 μM单次12-24小时或连续处理阶段15-44 阅读提示：Materials and Methods – Drug treatment；Figure 1 legend；Figure 6 legend |
| 尾部截肢与再生分析时间点 | 截肢位置为泄殖腔后第12肌节；再生分析时间点30天（谱系追踪）、21天（遗传操作）、26天（药物处理） 阅读提示：Materials and Methods – Single-cell transplantation；Figure 1、7、8 legends |
| 单细胞移植 | 供体他莫昔芬处理后14天分离CHERRY+细胞，移植至d/d宿主第12肌节后切口，2天后截肢，30天分析；移植细胞数量为单个细胞 阅读提示：Materials and Methods – Single-cell transplantation；Figure 3 legend |
| 药物抑制TGF-β/Wnt/MAPK | SB-431542 25 μM、IWR-1 25 μM、U0126 40 μM，截肢后3天开始，每日更换，2周或指定时间成像 阅读提示：Materials and Methods – Drug treatment；Figure 7 legend |
| 遗传操作TGF-β通路 | dTG-caTgfbr1和dTG-Smad7美西螈他莫昔芬诱导后截肢，21天分析；过表达验证见fig. S24 阅读提示：Figure 8 legend；figs. S21–S24 |
| scRNA-seq与空间转录组 | 采样时间点0、2、4、6、10、15、33天截肢后；胚胎他莫昔芬处理阶段15-25，阶段35收集；Stereo-seq使用阶段25胚胎 阅读提示：Materials and Methods – Animal preparation and cell dissociation for smart-seq2；Sample collection and spatial transcriptomics experiment |