构建内源性EF靶基因报告基因细胞系
建立可灵敏检测EWSR1::FLI1转录功能的报告体系，用于高通量筛选。
在A-673 EF-SMASh和TC-32 EF-SMASh细胞中将nLuc报告基因敲入DKK1和NR0B1的3’UTR，在野生型A-673中敲入IGFBP5-nLuc；用danoprevir诱导EF降解后验证nLuc活性变化。
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CDK8抑制诱导Mediator捕获并损害尤文肉瘤中EWSR1::FLI1转录程序
CDK8 inhibition induces Mediator trapping and impairment of the EWSR1::FLI1 transcriptional program in Ewing sarcoma
实验完整度
高含内源性报告基因HTS、CRISPR全基因组筛选、体外激酶实验、CUT&RUN/ChIP-seq/ATAC-seq及异种移植模型功能验证
主要模型
A-673尤文肉瘤细胞系（EF-SMASh、EF-AID及nLuc报告基因敲入） TC-32尤文肉瘤细胞系（EF-SMASh及nLuc报告基因敲入） A-673及TC-32皮下异种移植NCG小鼠模型
重点核对
HTS在A-673 EF-SMASh;DKK1-nLuc细胞中以10 μM化合物处理24小时，以TK-firefly luciferase控制细胞数，RZ score≥3定义为命中 验证筛选使用A-673 EF-SMASh;DKK1-nLuc和NR0B1-nLuc细胞，4点剂量（0.2、1.0、3.1、10 μM）处理24或48小时 STAT1-IFNγ assay：化合物预处理1.5小时，15 ng/mL IFNγ刺激1.5小时，免疫印迹检测pSTAT1(S727) 体外CDK8激酶模块 assay：20 nM CDK8复合物与化合物预孵育1小时，加入125 μM ATP和1 μM AFF4(S814)肽，反应1小时后40 mM EDTA终止 异种移植：A-673细胞皮下接种NCG小鼠，肿瘤约150 mm3时随机分组，30 mg/kg CCT251921口服每日一次给药15天
摘要
尤文肉瘤的特征是染色体易位导致融合蛋白EWSR1::FLI1。我们利用患者来源细胞系中的内源性EWSR1::FLI1靶基因报告基因进行高通量表型筛选，以鉴定损害EWSR1::FLI1转录程序的小分子。我们发现细胞周期蛋白依赖性激酶8（CDK8）抑制剂，包括一种新型吡啶基咪唑，改变了EWSR1::FLI1靶基因的转录，并且CDK8优先与EWSR1::FLI1在单一GGAA DNA结合基序上共定位。利用混合CRISPR筛选、生化研究和染色质分析，我们发现CDK8抑制剂通过诱导CDK8激酶模块和Mediator复合物在染色质上的分子捕获，以功能获得机制抑制尤文肉瘤细胞增殖。该机制对开发靶向转录的小分子具有启示，并提示转录调控复合物动力学的损害可能作为显性癌基因作为剂量敏感性转录因子的癌症中的脆弱性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CDK8在EWSR1::FLI1驱动的尤文肉瘤转录程序中发挥什么作用，以及CDK8抑制剂如何损害该程序并影响肿瘤生长。
- 核心机制
- CDK8抑制剂通过抑制CDK8激酶活性，诱导CDK8激酶模块与Mediator核心复合物在染色质上的分子捕获（CKM-MED trapping），从而改变EWSR1::FLI1靶基因转录并抑制尤文肉瘤细胞增殖。
- 主要证据
- 内源性EWSR1::FLI1靶基因nLuc报告基因HTS鉴定CDK8抑制剂；体外激酶实验显示ATP竞争性抑制；CRISPR筛选显示CKM亚基缺失 rescues SW393109效应；CUT&RUN和ChIP-seq显示CDK8和MED1在染色质上富集增加；异种移植显示CCT251921和BI-1347 modestly抑制肿瘤生长。
- 研究意义
- 研究提示分子捕获Mediator等大型动态转录调控复合物可能成为靶向转录的治疗策略框架，并表明转录调控复合物动力学损害可能作为剂量敏感性转录因子驱动癌症的脆弱性。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
高通量筛选EF转录程序调节剂
从大规模化合物库中鉴定能改变EWSR1::FLI1靶基因表达的 small molecules。
在384孔板中用A-673 EF-SMASh;DKK1-nLuc细胞筛选UTSW HTS Core小分子库，以TK-firefly luciferase控制细胞数，Promega DualGlo assay检测nLuc和firefly luciferase。
验证筛选命中并鉴定CDK8抑制剂
验证初级命中对EF报告基因的剂量依赖性活性，并判断其是否抑制CDK8。
对2303个初级命中用A-673 EF-SMASh;DKK1-nLuc和NR0B1-nLuc细胞进行4点剂量验证；用STAT1-IFNγ assay检测pSTAT1(S727)抑制；对27个重供化合物测试。
体外重建CDK8激酶模块并检测抑制剂活性
直接验证化合物对CDK8激酶活性的抑制作用及作用模式。
从昆虫细胞共表达纯化CDK8-Cyclin C-MED12-MED13复合物及亚复合物，用AFF4(S814)肽底物迁移率检测CDK8激酶活性，测试SW389108、SW393109、SW393108的剂量反应。
评估CDK8抑制对EF转录程序及染色质定位的影响
确定CDK8抑制是否广泛影响EWSR1::FLI1靶基因表达，以及CDK8与EF在基因组上的共定位关系。
用100 nM SW393109或CCT251921处理A-673和TC-32细胞24小时后RNA-seq；用ATAC-seq、CUT&RUN（CDK8、FLI1）和ChIP-seq（MED1）分析A-673细胞染色质定位；用A-673 EF-AID细胞和300 nM 5-Ph-IAA诱导EF降解后检测CDK8定位变化。
全基因组CRISPR筛选和CDK8急性降解验证功能获得机制
探究CDK8化学抑制与遗传缺失在尤文肉瘤细胞中的功能差异，验证SW393109是否通过CDK8以功能获得方式发挥作用。
在DMSO或100 nM SW393109条件下进行Brunello全基因组CRISPR/Cas9筛选16天；用细胞竞争 assay验证CKM和cMED亚基sgRNA；构建A-673 AIDCDK8;CDK19 KO细胞，用300 nM 5-Ph-IAA急性降解CDK8并与SW393109处理比较增殖和RNA-seq。
生化验证CKM-MED分子捕获
验证CDK8抑制是否增强CDK8激酶模块与Mediator核心复合物的结合及染色质捕获。
在A-673 3×FLAGCDK8和3×FLAGMED7敲入细胞中用100 nM SW393109或SW393108处理24小时，anti-FLAG免疫共沉淀检测CKM和cMED亚基；用免疫沉淀-质谱蛋白质组学独立评估；表达激酶失活D173A CDK8突变体验证激酶活性丧失是否足以诱导捕获。
评估CDK8抑制对细胞增殖和异种移植肿瘤生长的影响
确定CDK8抑制是否抑制尤文肉瘤细胞增殖和体内肿瘤生长。
用六种化学结构不同的CDK8抑制剂处理A-673和TC-32细胞5天，Vi-CELL计数检测增殖；用A-673和TC-32皮下异种移植NCG小鼠模型，口服给予CCT251921或BI-1347，测量肿瘤体积和重量。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
构建报告基因与敲入细胞系
高通量筛选与化合物验证
检测CDK8激酶活性
验证蛋白相互作用
评估细胞增殖与体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Sigma | D6429 |
| RPMI培养基 | Sigma | R7256 | |
| RPMI培养基 | Sigma | R8758-500ML | |
| 杀稻瘟菌素 | InvivoGen | ant-bl | |
| 新霉素 | Thermo Fisher Scientific | J67011-AE | |
| 嘌呤霉素 | Sigma | P8833 | |
| 高通量筛选 | Greiner Bio-One组织培养白色板 | Greiner Bio-One | 781098 |
| Echo 555声波液体处理器 | Beckman | -- | |
| Nano-Glo双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | N1650 | |
| Nano-Glo荧光素酶检测系统 | Promega | N1150 | |
| 布雷菲德菌素A | Cayman Chemical | 11861 | |
| EnVision多模式酶标仪 | PerkinElmer | -- | |
| CLARIOstar+多模式酶标仪 | BMG Labtech | -- | |
| BioTek MicroFlo液体处理器 | BioTek | -- | |
| STAT1-IFNγ assay | 干扰素γ | Invitrogen | RP8607 |
| Western blot | SuperSignal West Pico PLUS化学发光底物 | Thermo Scientific | -- |
| 4–12% Bis-Tris凝胶 | Invitrogen | -- | |
| Bolt MES SDS电泳缓冲液 | Invitrogen | -- | |
| 聚偏二氟乙烯膜 | Millipore | -- | |
| 蛋白纯化 | 抗FLAG M2磁珠 | Sigma | M8823 |
| 3×FLAG肽 | Sigma | F4199 | |
| 体外激酶 assay | Labchip EZ Reader | PerkinElmer | -- |
| RNA提取 | TRIzol | Thermo Fisher | 15596026 |
| CRISPR筛选 | lentiCas9-Blast | Addgene | 52962 |
| 人Brunello CRISPR敲除混合sgRNA文库 | Addgene | 73178 | |
| 血液与细胞培养DNA大提试剂盒 | Qiagen | 13362 | |
| 2× KAPA HiFi HotStart预混液 | Roche | KK2602 | |
| AMPure XP磁珠 | Beckman Coulter | A63881 | |
| 免疫沉淀 | 抗CDK8抗体 | Cell Signaling | 17395 |
| Protein A磁珠 | Thermo Fisher | 88845 | |
| 细胞活力 assay | CellTiter-Glo | Promega | G8462 |
| ChIP-seq | Spike-In染色质 | Active Motif | 53083 |
| Spike-in抗体 | Active Motif | 61686 | |
| H3K9ac抗体 | Abcam | 10812 | |
| H3K27ac抗体 | Active Motif | 39133 | |
| MED1抗体 | Bethyl | A300-793A | |
| NEBNext Ultra II DNA文库构建试剂盒 | New England Biolabs | -- | |
| Qubit dsDNA HS检测试剂盒 | Thermo Fisher | -- | |
| CUT&RUN | CUTANA ChIC/CUT&RUN试剂盒 | EpiCypher | 14-1048 |
| 刀豆蛋白A包被磁珠 | EpiCypher | 21-1401 | |
| 抗FLI1抗体（克隆7.3） | Santa Cruz Biotechnology | sc-53826 | |
| 抗CDK8抗体 | Proteintech | 22067-1-AP | |
| pAG-MNase | EpiCypher | 15-1016 | |
| 大肠杆菌spike-in DNA | EpiCypher | 18-1401 | |
| SPRIselect磁珠 | Beckman Coulter | B23318 | |
| ATAC-seq | Tagment DNA缓冲液和TDE1 Tagment DNA酶 | Illumina | 20034197 |
| Qiaquick PCR纯化试剂盒 | Qiagen | -- | |
| KAPA文库定量试剂盒 | KAPA | KK4854 | |
| 动物实验 | 基质胶 | Corning | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 高通量筛选 | 化合物筛选浓度：正文描述为10 μM，Methods HTS部分描述为2.5 μM，两处不一致需核对；化合物处理时间24小时；RZ score ≥ 3命中标准；阳性对照1 μM danoprevir；阴性对照10 μM brefeldin A 阅读提示：Results 'High-throughput screen for small molecule modulators of EF function'及Methods 'High-Throughput Screening' Primary Screen Conditions |
| 报告基因验证 assay | 4点剂量：0.2、1.0、3.1、10 μM；DKK1-nLuc assay处理24小时，NR0B1-nLuc assay处理48小时；IGFBP5-nLuc assay需doxycycline 250 ng/mL诱导shFLI1 阅读提示：Methods 'High-Throughput Screening' Secondary and Counter screen Conditions及Figure 1 legend |
| STAT1-IFNγ assay | 化合物预处理1.5小时，IFNγ 15 ng/mL刺激1.5小时；细胞铺板密度40%汇合度；免疫印迹检测pSTAT1(S727) 阅读提示：Methods 'STAT1-IFNγ Assay' |
| 体外CDK8激酶 assay | CDK8复合物20 nM；AFF4(S814)肽1 μM；ATP 125 μM（激酶模块 assay）或1 mM ATP（EZ Reader assay）；化合物与酶预孵育1小时；反应1小时后40 mM EDTA终止；CDK8复合物需包含CDK8、Cyclin C、MED12、MED13四组分才有强激酶活性 阅读提示：Methods 'In vitro Kinase assay'及Figure 1H legend |
| RNA-seq | SW393109或CCT251921 100 nM处理24小时；n=4（每个处理组）；差异表达基因阈值log2 ≥ 0.58或log2 ≥ 1（EF depletion） 阅读提示：Methods 'RNA extraction and RNA-sequencing'及Results 'CDK8 inhibition alters the EF gene expression program' |
| 全基因组CRISPR筛选 | Brunello文库MOI<0.3；~1000×覆盖度；SW393109 100 nM处理16天；细胞每4天传代，维持~1×10^8细胞；DMSO和SW393109组传代至累积倍增差异~6倍 阅读提示：Methods 'Genome-Wide CRISPR-Cas9 Screening' |
| CUT&RUN和ChIP-seq | CUT&RUN每反应5.5×10^5细胞，0.5 μg一抗，pAG-MNase 2.5 μL，染色质消化2小时；ChIP-seq spike-in normalization；SW393109 100 nM处理24小时 阅读提示：Methods 'CUT&RUN'、'ChIP-seq'及Figure 6 legend |
| 异种移植实验 | A-673细胞3×10^6细胞/只皮下接种NCG小鼠；肿瘤约150 mm3随机分组；CCT251921 30 mg/kg口服每日一次15天；BI-1347 25 mg/kg口服每日两次13-14天；CCT251921溶媒为0.5% methocel A4M/0.25% Tween 20或10% DMSO/10% Cremophor EL（两项研究不同） 阅读提示：Methods 'In vivo Xenograft Studies'及Figure 3 legend |