MIRO2介导的癌细胞向成纤维细胞的线粒体转移诱导癌症相关成纤维细胞分化

MIRO2-mediated mitochondrial transfer from cancer cells induces cancer-associated fibroblast differentiation

作者信息Michael Cangkrama, Huan Liu, Xiaoyu Wu, Josephine Yates, James Whipman, Christoph G Gäbelein, Mai Matsushita, Luca Ferrarese, Sibilla Sander, Francesc Castro-Giner, Simran Asawa, Magdalena K Sznurkowska, Manfred Kopf, Jörn Dengjel, Valentina Boeva, Nicola Aceto, Julia A Vorholt, Sabine Werner

PMID40877413

期刊Nat Cancer

发布时间2025-10

DOI10.1038/s43018-025-01038-6

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实验完整度

高

含体外共培养、线粒体移植、基因敲低/过表达、体内异种移植及患者样本组学分析等多层级证据与功能机制验证

主要模型

人原代皮肤成纤维细胞（HPFs）与A431等癌细胞共培养 A431、SCC13、MDA-MB-231、PANC1等癌细胞系 NOD scid小鼠耳部异种移植瘤模型患者皮肤SCC样本及scRNA-seq与空间转录组数据

重点核对

共培养中MitoTracker高阳性HPFs比例及TNT结构长度10–100 μm 线粒体移植后HPFs中INHBA、IL6、ACTA2、COL1A1等CAF标志物表达 MIRO2敲低或过表达对线粒体转移效率及CAF分化的影响 NOD scid小鼠中A431细胞与成纤维细胞共注射后的肿瘤体积 MitoCeption线粒体供体与受体HPFs数量比1:1

摘要

癌症相关成纤维细胞（CAFs）是肿瘤微环境的关键组分，通常支持癌症发生和进展。本文中我们展示，不同癌细胞在共培养和异种移植肿瘤中向成纤维细胞转移线粒体，从而诱导促肿瘤CAF特征。移植来自癌细胞的功能性线粒体诱导成纤维细胞代谢改变、CAF标志物表达以及促肿瘤分泌组和基质组释放。这些特征在临床前小鼠模型中促进肿瘤形成。机制上，线粒体转移需要线粒体运输蛋白MIRO2。在癌细胞中敲低MIRO2可抑制线粒体转移并抑制CAF分化和肿瘤生长。这些发现的临床相关性体现在上皮性皮肤癌前沿的肿瘤细胞中MIRO2过表达。这些结果确定癌细胞向成纤维细胞的线粒体转移是肿瘤发生的驱动因素，并为在不同恶性肿瘤中靶向MIRO2和线粒体转移提供依据。

建立癌细胞与成纤维细胞共培养体系

验证癌细胞是否向成纤维细胞转移线粒体。

将MitoTracker green标记的A431等癌细胞与未标记HPFs共培养24 h，检测MitoTracker高阳性HPFs及TNT样结构。

排除染料泄漏并验证转移途径

确认MitoTracker信号源于线粒体转移而非染料泄漏，并确定转移依赖TNT而非间隙连接。

采用transwell共培养、间隙连接抑制剂carbenoxolone、connexin 26敲低、微管抑制剂nocodazole、肌动蛋白抑制剂dihydrocytochalasin B及SEC3/SEC5敲低处理共培养体系。

体内验证线粒体转移

验证癌细胞在体内向基质成纤维细胞转移线粒体。

将A431细胞及Su9–RFP标记的A431细胞皮内注射至NOD scid小鼠耳部，对肿瘤切片进行人线粒体抗体与COLI/PDGFRα共染，并从肿瘤中分离培养小鼠成纤维细胞检测人mtDNA。

分析线粒体转移对成纤维细胞转录和蛋白特征的影响

评估接收癌细胞线粒体的成纤维细胞是否获得CAF表型。

FACS分选MitoTracker-high与-low HPFs，进行RNA-seq和蛋白质组学分析，检测CAF标志物、干扰素反应基因及功能特征。

线粒体移植直接诱导CAF重编程

验证纯化的癌细胞线粒体本身足以诱导致成纤维细胞CAF特征。

使用MitoCeption将A431等癌细胞来源的纯化线粒体移植入HPFs，并用FluidFM直接注射线粒体，检测增殖和CAF标志物表达。

验证功能性线粒体及MIRO2在转移和CAF诱导中的作用

确定线粒体功能及MIRO2对线粒体转移和CAF重编程的必要性。

使用CCCP去极化线粒体、低mtDNA（lmt）A431细胞线粒体、MIRO2敲低或过表达，检测线粒体转移效率、CAF标志物、OCR和肿瘤生长。

实验环节	名称	品牌	货号
细胞培养与线粒体染色	MitoTracker绿色荧光探针	Thermo Fisher Scientific	M46750
线粒体移植	线粒体分离试剂盒	Thermo Fisher Scientific	89874
线粒体氧化磷酸化抑制	寡霉素	Sigma-Aldrich	O4876
Seahorse线粒体压力测试	Seahorse XF细胞线粒体压力测试试剂盒	Agilent Technologies	103015-100
Seahorse检测	Seahorse XF基础培养基	Agilent Technologies	103335-100
ATP检测	CellTiter-Glo检测试剂盒	Promega	--
线粒体ROS检测	MitoSOX红色线粒体超氧化物指示剂	Thermo Fisher Scientific	M36008
流式细胞术	Sytox Blue核酸染料	Thermo Fisher Scientific	S34857
Foxp3转录因子染色缓冲液套装	eBioscience	00-5523-00
Western blot	抗MIRO2抗体	Novus Biologicals	H00089941-B01P
抗MIRO1抗体	Novus Biologicals	NBP1-59021
抗TRAK1抗体	Invitrogen	PA5-70029
抗TRAK2抗体	Invitrogen	PA5-21858
抗EXOC1抗体	Abcam	ab251853
抗EXOC2抗体	Abcam	ab140620
抗vinculin抗体	Sigma-Aldrich	V4505
抗GAPDH抗体	Hytest	5G4
抗HSP60抗体	Abcam	Ab59457
辣根过氧化物酶标记抗兔IgG	Promega	W4011
辣根过氧化物酶标记抗小鼠IgG	Promega	W4021
DNA提取	QIAamp DNA迷你试剂盒	Qiagen	51306
PCR产物纯化	QIAquick PCR纯化试剂盒	Qiagen	28104
蛋白质组学样品制备	SP3磁珠	GE Healthcare	45152105050250
SP3磁珠	GE Healthcare	65152105050250
双辛可宁酸蛋白定量试剂	Pierce Biotechnology, Thermo Fisher Scientific	PIER23225

实验环节

名称

品牌

货号

细胞培养与线粒体染色

MitoTracker绿色荧光探针

Thermo Fisher Scientific

M46750

线粒体移植

线粒体分离试剂盒

Thermo Fisher Scientific

89874

线粒体氧化磷酸化抑制

寡霉素

Sigma-Aldrich

O4876

Seahorse线粒体压力测试

Seahorse XF细胞线粒体压力测试试剂盒

Agilent Technologies

103015-100

Seahorse检测

Seahorse XF基础培养基

Agilent Technologies

103335-100

ATP检测

CellTiter-Glo检测试剂盒

Promega

线粒体ROS检测

MitoSOX红色线粒体超氧化物指示剂

Thermo Fisher Scientific

M36008

流式细胞术

Sytox Blue核酸染料

Thermo Fisher Scientific

S34857

Foxp3转录因子染色缓冲液套装

eBioscience

00-5523-00

Western blot

抗MIRO2抗体

Novus Biologicals

H00089941-B01P

抗MIRO1抗体

Novus Biologicals

NBP1-59021

抗TRAK1抗体

Invitrogen

PA5-70029

抗TRAK2抗体

Invitrogen

PA5-21858

抗EXOC1抗体

Abcam

ab251853

抗EXOC2抗体

Abcam

ab140620

抗vinculin抗体

Sigma-Aldrich

V4505

抗GAPDH抗体

Hytest

5G4

抗HSP60抗体

Abcam

Ab59457

辣根过氧化物酶标记抗兔IgG

Promega

W4011

辣根过氧化物酶标记抗小鼠IgG

Promega

W4021

DNA提取

QIAamp DNA迷你试剂盒

Qiagen

51306

PCR产物纯化

QIAquick PCR纯化试剂盒

Qiagen

28104

蛋白质组学样品制备

SP3磁珠

GE Healthcare

45152105050250

SP3磁珠

GE Healthcare

65152105050250

双辛可宁酸蛋白定量试剂

Pierce Biotechnology, Thermo Fisher Scientific

PIER23225

环节	核对要点
癌细胞与成纤维细胞共培养	癌细胞系、HPF来源与代数、MitoTracker green浓度、共培养时长24 h、共培养比例及n=3重复阅读提示：Methods“Coculture of fibroblasts with epithelial cells”及Fig. 1图注
线粒体转移途径验证	carbenoxolone 100 μM、nocodazole 10 μM、dihydrocytochalasin B 100 nM处理24 h；siRNA序列与转染时长阅读提示：Methods“Coculture of fibroblasts with epithelial cells”和“siRNA-mediated knockdown”
MitoCeption线粒体移植	供体细胞数与受体HPFs数量比1:1、1,500g离心15 min 4°C、37°C 5% CO2孵育2 h、重复离心一次、24 h后检测阅读提示：Methods“MitoCeption”及Fig. 4图注
体内异种移植瘤实验	NOD scid小鼠8–12周龄、皮内注射2×10^5癌细胞或10^5癌细胞+10^5成纤维细胞、肿瘤体积检测时间点、n=3–5只小鼠/组阅读提示：Methods“In vivo tumorigenesis assays”及Fig. 5、Fig. 8图注
MIRO2功能验证	MIRO2 siRNA序列及24 h转染、MIRO2过表达质粒pRK5-myc-MIRO2（Addgene 47891）、检测线粒体转移的MitoTracker高阳性HPFs比例阅读提示：Methods“siRNA-mediated knockdown”和“MIRO2 overexpression”及Fig. 7图注
代谢功能检测	Seahorse XF96每孔100,000细胞、oligomycin/FCCP/antimycin A+rotenone终浓度分别为1、1.5、1/0.1 μmol/L、OCR归一化至细胞数阅读提示：Methods“Seahorse XF cell mito stress test”及Fig. 5图注

环节

核对要点

癌细胞与成纤维细胞共培养

癌细胞系、HPF来源与代数、MitoTracker green浓度、共培养时长24 h、共培养比例及n=3重复

阅读提示：Methods“Coculture of fibroblasts with epithelial cells”及Fig. 1图注

线粒体转移途径验证

carbenoxolone 100 μM、nocodazole 10 μM、dihydrocytochalasin B 100 nM处理24 h；siRNA序列与转染时长

阅读提示：Methods“Coculture of fibroblasts with epithelial cells”和“siRNA-mediated knockdown”

MitoCeption线粒体移植

供体细胞数与受体HPFs数量比1:1、1,500g离心15 min 4°C、37°C 5% CO2孵育2 h、重复离心一次、24 h后检测

阅读提示：Methods“MitoCeption”及Fig. 4图注

体内异种移植瘤实验

NOD scid小鼠8–12周龄、皮内注射2×10^5癌细胞或10^5癌细胞+10^5成纤维细胞、肿瘤体积检测时间点、n=3–5只小鼠/组

阅读提示：Methods“In vivo tumorigenesis assays”及Fig. 5、Fig. 8图注

MIRO2功能验证

MIRO2 siRNA序列及24 h转染、MIRO2过表达质粒pRK5-myc-MIRO2（Addgene 47891）、检测线粒体转移的MitoTracker高阳性HPFs比例

阅读提示：Methods“siRNA-mediated knockdown”和“MIRO2 overexpression”及Fig. 7图注

代谢功能检测

Seahorse XF96每孔100,000细胞、oligomycin/FCCP/antimycin A+rotenone终浓度分别为1、1.5、1/0.1 μmol/L、OCR归一化至细胞数

阅读提示：Methods“Seahorse XF cell mito stress test”及Fig. 5图注

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