NaB安全性评估
确定NaB对宿主细胞和小鼠眼表的无毒性工作浓度。
用CCK-8检测RAW 264.7细胞和HCECs活力，划痕实验检测HCECs迁移，荧光素钠染色评估小鼠眼表上皮毒性。
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丁酸钠通过发挥抗真菌活性并经Nrf2/HO-1轴抑制炎症减轻真菌性角膜炎
Sodium Butyrate Alleviates Fungal Keratitis by Exerting Antifungal Activity and Dampening Inflammation Through the Nrf2/HO-1 Axis
实验完整度
高含体外细胞、真菌及小鼠FK模型三个独立证据层级，并进行了Nrf2/HO-1抑制剂机制验证。
主要模型
RAW 264.7细胞 人角膜上皮细胞（HCECs） 烟曲霉（A. fumigatus） C57BL/6小鼠烟曲霉角膜炎模型
重点核对
NaB工作浓度：体外1–4 mM，体内4 mM（5 µL，每日4次，感染后第1–3天） 烟曲霉刺激RAW 264.7细胞和HCECs使用75%乙醇灭活过夜的菌丝，浓度5 × 10⁶ CFU/mL Nrf2/HO-1通路抑制：BT 15 nM预处理2小时，ZnPP 10 µM预处理2小时，再以4 mM NaB处理 小鼠FK模型：左角膜基质层接种烟曲霉1 × 10⁸ CFU/mL，感染后24小时开始治疗 临床评分每组7只小鼠，角膜真菌负荷每组3只角膜，细胞实验和动物研究至少3次独立重复
摘要
目的：本研究旨在确定丁酸钠（NaB）是否通过联合抗真菌作用和Nrf2/HO-1相关的抗炎作用来减轻真菌性角膜炎（FK）。方法：通过Cell Counting Kit-8实验、划痕实验和荧光素钠染色评估NaB的安全性。通过最小抑菌浓度实验、结晶紫染色、碘化丙啶摄取、卡尔科弗卢白染色、分生孢子黏附实验以及扫描和透射电子显微镜评估对烟曲霉（A. fumigatus）的抗真菌活性。通过qRT-PCR检测烟曲霉中HSP90和RpdA的mRNA水平。在小鼠FK模型中，通过临床角膜评分、苏木精-伊红（H&E）染色和真菌平板计数检查治疗效果。采用qRT-PCR、ELISA和Western blotting分析炎症反应。结果：在浓度高达4 mM时，NaB对RAW 264.7细胞、人角膜上皮细胞和小鼠眼表面上皮未显示出明显毒性。体外，NaB抑制烟曲霉分生孢子萌发和生物膜形成，破坏真菌细胞壁和细胞膜，降低分生孢子对上皮细胞的黏附，并下调HSP90和RpdA。电子显微镜证实了菌丝超微结构损伤。体内，NaB减少角膜真菌负荷，改善临床表现，并减少炎症细胞浸润。机制上，NaB激活Nrf2/HO-1通路并降低IL-6、IL-1β和TNF-α表达。结论：NaB在烟曲霉角膜炎中发挥抗真菌和抗炎作用，支持其作为FK治疗策略的潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- NaB是否能够通过联合抗真菌和Nrf2/HO-1相关抗炎作用减轻烟曲霉性角膜炎。
- 核心机制
- NaB直接抑制烟曲霉生长、生物膜形成和黏附并破坏菌丝结构，同时激活Nrf2/HO-1通路、下调IL-6、IL-1β和TNF-α，从而减轻炎症。
- 主要证据
- 体外通过MIC、结晶紫、CFW/PI染色、黏附实验、SEM/TEM和qRT-PCR验证抗真菌作用；小鼠FK模型通过临床评分、CFU计数和H&E染色验证疗效；RAW 264.7细胞经BT/ZnPP预处理验证Nrf2/HO-1通路参与抗炎作用。
- 研究意义
- NaB在烟曲霉角膜炎中兼具抗真菌和抗炎作用，支持其作为FK治疗策略进一步研究的潜力。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
NaB体外抗烟曲霉活性检测
评估NaB对烟曲霉生长、生物膜形成和分生孢子黏附的抑制作用。
MIC实验检测生长抑制，结晶紫染色检测生物膜，黏附实验检测分生孢子对HCECs的黏附。
NaB对烟曲霉细胞壁、膜及超微结构的破坏检测
验证NaB是否破坏真菌细胞壁、细胞膜和菌丝超微结构。
CFW染色检测细胞壁完整性，PI染色检测膜通透性，SEM和TEM观察菌丝形态和超微结构。
NaB对烟曲霉HSP90和RpdA表达的影响检测
初步探索NaB抗真菌作用的分子背景。
qRT-PCR检测烟曲霉HSP90和RpdA mRNA水平。
小鼠FK模型治疗 efficacy 评估
验证NaB在体内减轻烟曲霉角膜炎的疗效。
建立小鼠FK模型，分组给予PBS、NaB或NATA，进行临床评分、角膜真菌负荷CFU计数和H&E染色。
NaB体内外抗炎效应检测
评估NaB对烟曲霉诱导的炎症因子表达的抑制作用。
qRT-PCR和ELISA检测小鼠角膜及RAW 264.7细胞中IL-6、IL-1β和TNF-α表达。
Nrf2/HO-1通路机制验证
验证NaB抗炎作用是否依赖Nrf2/HO-1通路。
Western blot检测Nrf2和HO-1蛋白，使用BT或ZnPP预处理后检测Nrf2/HO-1及炎症因子变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| NaB安全性评估 | NaB浓度梯度（1–5 mM）、处理时间24小时、CCK-8试剂用量10 µL、孵育2小时、检测波长450 nm；划痕实验NaB 4 mM处理12小时；小鼠滴眼4 mM NaB 4 µL每日4次共5天。 阅读提示：Methods中Cell Counting Kit-8、Cell Scratch Assay、Corneal Safety Assay小节及Figure 1图注。 |
| 体外抗真菌活性 | 烟曲霉分生孢子接种浓度（MIC未明确）、培养温度37°C和时间36小时；生物膜实验分生孢子1 × 10⁵ CFU/mL、NaB 1–5 mM、培养24小时；黏附实验NaB 4 mM。 阅读提示：Methods中Minimum Inhibitory Concentration、Biofilm Formation Inhibition Test小节及Figure 2图注。 |
| 真菌细胞壁/膜及超微结构检测 | CFW/PI实验中菌丝培养24小时后NaB 2或4 mM处理24小时；SEM/TEM中分生孢子2 × 10⁵ CFU/mL、4 mM NaB处理24小时。 阅读提示：Methods中Calcofluor White Staining and Propidium Iodide Staining、Scanning Electron Microscopy and Transmission Electron Microscopy小节及Figure 2、Figure 3图注。 |
| 小鼠FK模型建立与治疗 | C57BL/6雌性小鼠8周龄；左角膜基质层接种烟曲霉1 × 10⁸ CFU/mL；感染后24小时开始治疗，NaB 4 mM（5 µL）、NATA 8 µg/mL（5 µL）或PBS（5 µL），每日4次，第1–3天；临床评分n = 7只/组，CFU计数n = 3只/组。 阅读提示：Methods中Establishment of FK Models in Mice、Corneal Fungal Burden, CFU Counts小节及Figure 4图注。 |
| 炎症因子检测 | 小鼠角膜第3天取材；RAW 264.7细胞以灭活烟曲霉菌丝5 × 10⁶ CFU/mL刺激，4 mM NaB处理8小时（qRT-PCR）或24小时（ELISA）。 阅读提示：Methods中Enzyme Linked Immunosorbent Assay、Quantitative Reverse Transcription PCR小节及Figure 5图注。 |
| Nrf2/HO-1通路机制验证 | RAW 264.7细胞以灭活烟曲霉菌丝刺激；BT 15 nM或ZnPP 10 µM预处理2小时，再以4 mM NaB处理；Western blot 24小时检测，qRT-PCR 8小时检测，ELISA 24小时检测。 阅读提示：Methods中Treatment of Nrf2/HO-1 Inhibitor、Western Blot小节及Figure 6图注。 |