鉴定胰岛HGF的内源性来源
确定健康胰岛中HGF主要由哪种细胞类型表达。
分析人胰岛scRNAseq数据集中HGF表达；qPCR比较小鼠肝脏、胰腺、胰岛、周细胞、内皮细胞和免疫细胞的Hgf表达；免疫荧光检测HGF与PDGFRβ共定位；ELISA检测原代周细胞条件培养基HGF分泌。
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胰腺周细胞内源性产生的HGF调节β细胞功能
HGF Endogenously Produced by Pancreatic Pericytes Regulates β-Cell Function
实验完整度
高结合人胰岛scRNAseq、小鼠细胞群qPCR、周细胞特异性Hgf敲除小鼠、体外胰岛培养及功能检测，含功能和机制验证。
主要模型
ΔHgfPeri小鼠（Nkx3.2-Cre;Hgfflox/flox） 对照小鼠（Hgfflox/flox，Cre阴性） 离体小鼠胰岛 原代新生小鼠胰腺周细胞
重点核对
周细胞特异性Hgf敲除效率：ΔHgfPeri胰岛中HGF+周细胞比例<5%，对照约55% 葡萄糖耐量试验：10周龄雄性ΔHgfPeri与对照比较AUC，15周龄雌性比较AUC 离体胰岛GSIS：1.67 vs 16.7 mmol/L葡萄糖，10个大小匹配胰岛 胰岛Ins1、Ins2、Pdx1、Neurod1、Slc2a2表达：ΔHgfPeri vs 对照，n=4–9 c-Met抑制剂PHA-665752处理野生型胰岛6、9、12小时检测Pdx1、Ins1、Slc2a2表达
摘要
肝细胞生长因子（HGF）/c-Met信号通路是已知的通过外部信号调节β细胞适应性和功能的通路。然而，胰岛中HGF的内源性来源及其在此背景下的生理作用仍不清楚。在此，我们结合人类胰岛单细胞转录组学和小鼠胰腺细胞图谱分析，显示周细胞而非内皮细胞是健康胰岛中HGF的主要来源。利用转基因小鼠工具和培养系统，我们发现周细胞来源的HGF是β细胞功能和葡萄糖稳态所必需的。胰腺中缺乏周细胞HGF的成年小鼠出现葡萄糖不耐受，同时维持β细胞量和胰岛素敏感性。机制上，胰腺周细胞分泌的HGF通过调节关键β细胞基因（包括Pdx1、Slc2a2和Ins1）的表达，是正常胰岛素产生和分泌所必需的。此外，缺乏间充质/周细胞HGF的新生和妊娠小鼠β细胞量较低，表明其对β细胞扩增的需求具有背景依赖性。因此，我们认为周细胞HGF在稳态期间是胰岛素产生和分泌所必需的，并在胚胎发生和妊娠期间支持β细胞扩增。总之，我们的发现确立了周细胞作为HGF的重要内源性来源，将胰岛微血管系统与胰岛素产生和葡萄糖稳态偶联。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 胰岛中HGF的内源性细胞来源是什么，以及内源性HGF在体内对生理性β细胞功能有何贡献？
- 核心机制
- 周细胞分泌的HGF通过激活β细胞c-Met信号，调节关键β细胞基因（Pdx1、Neurod1、Slc2a2、Ins1/Ins2）表达，从而维持胰岛素产生和分泌；Pdx1可能是较早响应者，Ins1和Slc2a2变化可能在其下游。
- 主要证据
- 人胰岛scRNAseq和小鼠细胞群qPCR显示周细胞富集HGF；周细胞特异性Hgf敲除小鼠出现葡萄糖不耐受但β细胞量正常，离体胰岛GSIS和胰岛素含量降低，rHGF可挽救Ins1和Slc2a2表达，c-Met抑制剂降低Ins1表达；妊娠和新生小鼠β细胞量降低。
- 研究意义
- 确立周细胞为胰岛HGF的重要内源性来源，将胰岛微血管系统与胰岛素产生和葡萄糖稳态偶联，提示局部微血管信号改变可能驱动糖尿病中的β细胞衰竭。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
构建周细胞特异性Hgf敲除小鼠并验证敲除效率
在体内特异性删除周细胞Hgf以研究其生理功能。
将Hgfflox/flox小鼠与Nkx3.2-Cre小鼠杂交获得ΔHgfPeri小鼠；qPCR检测分选周细胞Hgf表达；免疫荧光检测胰岛HGF+PDGFRβ+细胞比例。
评估周细胞HGF缺失对葡萄糖稳态的影响
检验周细胞来源HGF是否在稳态下调节血糖。
对ΔHgfPeri和对照小鼠进行体重、胰岛素耐量试验、空腹和随机血糖、葡萄糖耐量试验；高脂饮食诱导肥胖模型也进行GTT。
评估周细胞HGF缺失对β细胞量和胰岛素产生的影响
确定葡萄糖不耐受是否由β细胞量或胰岛素产生/分泌缺陷导致。
测量β细胞量、β/α细胞比、离体胰岛GSIS、胰腺和胰岛胰岛素含量、β细胞基因表达；用c-Met抑制剂和rHGF在离体胰岛中验证。
研究周细胞HGF在妊娠和发育中的作用
检验周细胞HGF是否在妊娠和胚胎期支持β细胞扩增。
检测妊娠GD18和未妊娠小鼠分选周细胞Hgf表达；对妊娠ΔHgfPeri和对照进行GTT和β细胞量分析；检测E17.5、P0、P21β细胞量和胰岛素含量，P5β细胞增殖。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证机制链路
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 葡萄糖耐量试验 | 葡萄糖 | Sigma-Aldrich | D9434 |
| 胰岛素耐量试验 | 胰岛素 | Eli Lilly | HI0210 |
| 血糖测量 | Contour血糖仪 | Bayer | -- |
| 胰岛分离 | P型胶原酶 | Roche | 11213865001 |
| Histopaque-1119 | Sigma-Aldrich | 11191 | |
| 单细胞分离 | DNase I | Sigma-Aldrich | D5025 |
| 流式细胞术 | Fc受体阻断剂 | Invitrogen | 14–0161-85 |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| 流式细胞分选 | FACSAria III细胞分选仪 | BD Biosciences | -- |
| 免疫荧光 | Citra缓冲液 | BioGenex | HK086-9 K |
| TSA封闭粉 | Akoya Biosciences | FP1020 | |
| HCS CellMask深红色染料 | Thermo Fisher Scientific | H32721 | |
| 功能血管分析 | 荧光素标记番茄凝集素 | Vector Laboratories | FL-1171 |
| HGF分泌检测 | 小鼠HGF ELISA试剂盒 | R&D Systems | MHG00 |
| GSIS | RPMI培养基 | -- | -- |
| 葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| 胰岛素含量检测 | 小鼠高范围胰岛素ELISA试剂盒 | Alpco | 80-INSMSH-E01 |
| 蛋白浓度测定 | Pierce BCA蛋白测定试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23227 |
| HGF/c-Met操作 | PHA-665752 | MedChemExpress | HY-11107 |
| 重组小鼠HGF | R&D Systems | 2207-HG-025/CF | |
| 基因表达分析 | PureLink RNA提取试剂盒 | Invitrogen | 12183 |
| High-Capacity cDNA逆转录试剂盒 | Applied Biosystems | 4374966 | |
| qPCR | QuantStudio 5实时PCR系统 | Applied Biosystems | -- |
| 组织匀浆 | TissueLyser II组织匀浆仪 | Qiagen | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 周细胞特异性Hgf敲除与验证 | 小鼠基因型：Nkx3.2-Cre;Hgfflox/flox（ΔHgfPeri）与Cre阴性对照；敲除效率需核对分选周细胞Hgf表达及胰岛HGF+PDGFRβ+细胞比例 阅读提示：Methods的Mice小节；Results的Loss of Pericytic HGF Disrupts Glycemic Control in Homeostasis及Figure 1G–H |
| 葡萄糖耐量试验与胰岛素耐量试验 | 禁食时间（GTT 16小时，ITT 6小时）、注射剂量（dextrose 2 mg/g体重，胰岛素0.75 U/kg）、性别和年龄（雄性10周龄，雌性15周龄）及样本量 阅读提示：Methods的Glucose and Insulin Tolerance Tests小节；Figure 2D–G及Supplementary Fig. 2 |
| 离体胰岛GSIS与胰岛素含量 | 胰岛数量（10个大小匹配）、葡萄糖浓度（1.67和16.7 mmol/L）、孵育时间（预孵育30分钟，刺激1小时）、胰岛素ELISA试剂盒；ΔHgfPeri胰岛来源小鼠年龄和性别 阅读提示：Methods的Cell Culture and Protein Measurements小节；Figure 3D–G及Supplementary Fig. 4 |
| c-Met抑制剂与rHGF处理离体胰岛 | PHA-665752浓度（1 μmol/L）和处理时间（24小时或6/9/12小时）；rHGF浓度（20 ng/mL）和处理时间（24小时）；每组胰岛数量（50个） 阅读提示：Methods的Cell Culture and Protein Measurements小节；Figure 3I–J及Figure 4B、D–G |
| 妊娠和胚胎期β细胞量分析 | 妊娠时间（GD18）；切片策略（胚胎/新生每第五张切片，成年每隔100 μm）；β细胞量计算公式（胰岛素阳性面积/总胰腺面积×胰腺重量）；样本量 阅读提示：Methods的Morphometric Analyses小节；Figure 5D及Figure 6E、G |