胎盘组织采集与绒毛外植体分离
获取可用于成像的完整连通绒毛树外植体。
足月胎盘取自胎盘中央的绒毛叶，去除蜕膜层获得约27 cm³（3×3×3 cm）含绒毛膜板的外植体，PBS清洗三次每次10分钟；妊娠早期胎盘从胎膜分离绒毛组织，取约1 cm长、含终末绒毛的单一绒毛分支树，修剪为约1 cm³外植体并在PBS中短暂清洗。
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贯穿妊娠期的人胎盘血管系统光片荧光显微成像与分析流程
Light sheet fluorescence microscopy pipelines for imaging and analysis of the human placental vasculature across gestation†
实验完整度
中包含组织透明化、免疫荧光标记、LSFM成像及两类图像分割分析流程，基于妊娠早期与足月胎盘外植体，但以方法学流程展示为主。
主要模型
妊娠早期三个月人胎盘绒毛外植体 足月人胎盘绒毛外植体
重点核对
外植体体积：妊娠早期约1 cm³，足月约0.125 cm³（由0.5 cm绒毛树修剪获得） 抗体工作浓度：Alexa Fluor 647 anti-CD31与Alexa Fluor 488 anti-cytokeratin 7均为1.67 μg/mL，孵育4°C过夜 透明化：Visikol HISTO-1于4°C 48 h，随后HISTO-2于4°C至少48 h 成像物镜与体素：妊娠早期4×/0.28 NA检测物镜、4 μm光片、1.62×1.63×2.00 μm体素；足月10×/0.6 NA检测物镜、1.5 μm光片、0.65×0.65×1 μm体素 Z步进：妊娠早期2 μm、足月1 μm；488与638 nm通道曝光时间均为70 ms
摘要
在妊娠早期三个月内，血管发生（血管的从头形成）与血管生成（由已有血管生成新血管）共同构建了胎盘血管网络的骨架，随着妊娠进展至足月，该网络变得日益复杂。已有多种离体成像手段用于详细研究人胎盘的血管结构，包括计算机断层扫描、同步辐射X射线断层扫描、共聚焦显微镜与电子显微镜，以及传统组织学和体视学。然而，这些技术大多在分辨率、最大样本尺寸与成本之间需要权衡。光片荧光显微镜（LSFM）是一种有吸引力的方法，能够在微尺度上对胎盘三维形态进行成像，同时也能对相对更大的胎盘外植体进行成像，从而捕获更多代数的绒毛树和血管树。用于光学成像的组织透明化技术的进步催生了大量针对不同组织类型发表的LSFM方案。然而，针对胎盘的方案优化对于高质量成像及对该独特组织的下游三维分析至关重要。此外，胎盘血管结构以排列无序、异质性强和迂曲著称，使其分割和获得有意义的数据比在其他器官系统的血管中更具挑战性。在此，我们提出了一套用于妊娠早期三个月和足月人胎盘绒毛外植体组织制备、光片荧光成像与图像分割的综合流程，从而能够对妊娠不同阶段的血管结构进行具有生理相关性的定量分析。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何针对妊娠早期与足月人胎盘组织建立可重复、可扩展的高质量光片荧光显微三维成像与定量分析流程，以刻画不同妊娠阶段胎盘绒毛与血管结构。
- 核心机制
- 通过优化组织透明化、免疫荧光标记与LSFM成像条件，并对妊娠早期与足月数据集采用不同的分割策略（前者基于Imaris机器学习表面分割与细丝追踪，后者基于半自动阈值分割结合骨架化），实现对胎盘血管三维形态的定量。
- 主要证据
- 以Alexa Fluor 647 anti-CD31标记血管内皮、Alexa Fluor 488 anti-cytokeratin 7标记滋养层，对妊娠早期和足月胎盘绒毛外植体进行透明化与LSFM成像；妊娠早期数据集通过Imaris机器学习分割与Filaments模块获得血管长度、直径、分支角与分支点密度等指标，足月数据集通过3D Slicer与ITK-SNAP半自动分割结合骨架化获得血管形态计量。
- 研究意义
- 作者指出该流程可获得具有生理相关性的完整三维胎盘结构数据，用于比较不同妊娠阶段或病理状态下的血管结构，并可为胎盘网络模型、多孔介质模型、计算流体动力学模型及代表性体积单元等计算建模提供参数。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
组织固定与漂白
固定组织并降低内源性色素引起的自发荧光。
外植体于4% PFA中室温过夜固定，次晨PBS清洗1小时（2×30分钟）；随后用递增浓度乙醇（50%、80%、100%）于4°C各1小时脱水，再转入漂白液于4°C过夜。
免疫荧光标记
标记血管内皮细胞与绒毛外层滋养层。
样本经梯度乙醇复水，Penetration Buffer于4°C孵育1小时，6% NGS封闭48小时，随后与Alexa Fluor 647 anti-CD31和Alexa Fluor 488 anti-cytokeratin 7抗体于4°C避光过夜孵育，再用Washing Buffer清洗三次。
光学透明化与LSFM成像
使组织透明以增加成像深度，并采集三维荧光图像。
样本经递增乙醇脱水后，依次用Visikol HISTO-1和HISTO-2透明化，随后在PhaseView Alpha3光片荧光显微镜上成像，成像腔充填Visikol HISTO-2（RI 1.53），488与638 nm激光激发，采用X-Y拼接采集整个外植体。
妊娠早期图像分割与细丝追踪分析
分割血管与绒毛体积并提取血管形态参数。
在Imaris中将拼接后的数据集进行背景扣除（CK7通道30 μm、CD31通道90 μm高斯滤波），利用Surfaces模块的机器学习Classifier分割CD31血管与CK7绒毛，血管体积以绒毛体积归一化计算血管密度；再将分割血管导出为二值掩膜，用Filaments模块进行多 seed 点细丝追踪，获得血管参数。
足月图像半自动分割与骨架化分析
处理结构更复杂、密度更高的足月血管网络。
足月数据集导出为TIF后镶嵌为八个较小数据集，每块在3D Slicer中按阈值生成初始二值掩膜，ITK-SNAP中手动修正（填充无染色血管腔、分离粘连血管），并施加沿Z轴的1体素线核二值开运算；重组后以SciPy实现的Lee算法进行三维骨架化并转换为血管树图，计算血管形态计量。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 组织漂白 | 30%过氧化氢 | Sigma-Aldrich | H1009-100ML |
| 免疫荧光标记 | Alexa Fluor 488抗细胞角蛋白7抗体 | ABCAM | EPR1619Y |
| Alexa Fluor 647抗CD31抗体 | ABCAM | EPR17259 | |
| 组织脱水 | 乙醇 | Sigma-Aldrich | E7023-1 L |
| 缓冲液配制 | 甘氨酸 | Sigma-Aldrich | G8898 |
| 肝素钠盐 | Sigma-Aldrich | H3393 | |
| 光学透明化 | HISTO-1透明化试剂 | Visikol | H1-30 |
| HISTO-2透明化试剂 | Visikol | H2-100 | |
| 组织漂白 | 甲醇 | Sigma-Aldrich | 34,860-100ML-R |
| 封闭 | 正常山羊血清 | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 |
| 缓冲液配制 | Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 |
| 二甲基亚砜 | ThermoFisher | J66650.AE | |
| 组织处理 | 聚丙烯管 | Interlab | BCS-500S |
| 组织分离 | 解剖显微镜 | Nikon | SMZ800N |
| 成像 | 光片荧光显微镜 | PhaseView | Alpha3 Facility Edition |
| 成像采集 | QtSPIM采集软件 | PhaseView | -- |
| 图像处理与分割 | Imaris三维可视化与分割软件 | Oxford instruments | -- |
| 图像格式转换 | Imaris文件转换器 | Oxford instruments | -- |
| 图像拼接 | Imaris拼接软件 | Oxford instruments | -- |
| 图像分割与可视化 | ITK-SNAP | University of Pennsylvania | -- |
| 3D Slicer | Slicer.org | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 胎盘组织采集与外植体分离 | 妊娠早期与足月胎盘的纳入/排除标准；足月外植体体积27 cm³、妊娠早期外植体约1 cm³；足月PBS清洗3次×10分钟 阅读提示：Methods中Placental collection与Tissue preparation小节，及Figure 1图注 |
| 组织固定与漂白 | 4% PFA室温过夜固定；乙醇梯度各1小时于4°C；漂白液30% H₂O₂/甲醇/DMSO按1:4:1，4°C过夜；外植体适用体积0.5–1.5 cm³ 阅读提示：Methods中Tissue fixation与Bleaching小节 |
| 免疫荧光标记 | 抗体浓度1.67 μg/mL；封闭6% NGS 48小时；抗体4°C避光过夜；Washing Buffer清洗三次每次30分钟 阅读提示：Methods中Immunofluorescent labelling小节及Table 2 |
| 光学透明化 | HISTO-1 4°C 48小时；HISTO-2 4°C至少48小时；HISTO-2折射率1.53 阅读提示：Methods中Optical clearing小节及Figure 3图注 |
| LSFM成像 | 妊娠早期与足月分别使用4×/0.28 NA与10×/0.6 NA检测物镜；光片厚度4 μm与1.5 μm；体素1.62×1.63×2.00 μm与0.65×0.65×1 μm；Z步进2 μm与1 μm；曝光70 ms；拼接2×2或2×1 阅读提示：Methods中Light sheet fluorescence microscopy小节 |
| 图像分割与分析 | 妊娠早期高斯滤波宽度CK7 30 μm、CD31 90 μm，分类器训练ROI约占数据集30%；足月镶嵌为2×2×2八块并进行手动修正与二值开运算 阅读提示：Methods中Image processing、First trimester与Third trimester小节，及Figure 4、Figure 6、Figure 8图注 |