靶向HLA-G和CD70的亲和力优化双特异性CAR-T细胞用于治疗透明细胞肾细胞癌

背景：透明细胞肾细胞癌（ccRCC）的治疗选择有限。近期临床试验显示嵌合抗原受体（CAR）-T细胞疗法治疗ccRCC有效。然而，靶抗原的异质性表达驱动免疫逃逸并损害疗效。共同靶向两种肿瘤相关抗原的双特异性CAR可能克服这一局限。方法：使用公共RNA测序数据库和患者样本的免疫组织化学分析正常和癌组织中人类白细胞抗原-G（HLA-G）和CD70的表达。利用HLA-G的天然受体人抑制性受体Ig样转录本4（ILT4）构建HLA-G CAR。通过基于结构的合理设计提高ILT4与HLA-G的结合亲和力。然后将CD70纳米抗体序列整合到HLA-G CAR中，生成HLA-G/CD70双特异性CAR，同时加入靶向CD70的短发夹RNA（shRNA）以防止CAR-T细胞自相残杀。比较两个抗原结合结构域之间的一组连接肽以优化CAR信号，并在异质性肿瘤模型中体外和体内评估先导候选物。结果：HLA-G和CD70被确定为理想的雙特异性CAR-T靶点，以克服ccRCC的异质性。获得了一种与HLA-G结合亲和力增强的ILT4突变体（Mut-5）。源自该高亲和力ILT4突变体的HLA-G CAR引发增强的抗原特异性细胞毒性。随后通过优化（G4S）2连接肽将亲和力优化的ILT4突变体与CD70纳米抗体连接，开发了HLA-G/CD70双特异性CAR。为避免由CD70表达介导的双特异性CAR-T细胞自相残杀，我们将CD70 shRNA整合到载体中。双特异性CAR分别对两种抗原显示特异性细胞毒性，并对双阳性肿瘤细胞介导高抗肿瘤活性。双特异性CAR-T细胞在体内有效抑制异质性肿瘤生长，与单靶点CAR-T细胞相比表现出较少的耗竭。结论：我们建立了一种亲和力优化的HLA-G/CD70双特异性CAR，作为克服ccRCC中抗原异质性介导的耐药和免疫逃逸的有前景的策略。