建立人Treg细胞失稳体外模型
验证人Treg细胞在炎症细胞因子反复刺激下是否失去谱系身份。
FACS分选CD4+CD25+CD127lo/−原代人Treg细胞，每9天以CD3/CD28刺激，在IL-2单独或联合IL-6、IL-1β、IL-23条件下培养，于各周期第7天流式检测FOXP3和HELIOS。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
缺失远端IRF4调控元件可阻止炎症诱导的人调节性T细胞命运重编程
Deletion of a distal IRF4 element prevents inflammation-induced reprogramming of human regulatory T cell fate
实验完整度
高体外原代人Treg失稳模型、单细胞多组学、CRISPR编辑、CRISPRa过表达及异种GvHD小鼠模型，含功能与机制验证
主要模型
原代人CD4+CD25+CD127lo/− Treg细胞体外失稳模型 原代人CD4+CD25−CD127+ Tconv细胞 NSG小鼠异种GvHD模型
重点核对
人Treg细胞每9天以CD3/CD28刺激，持续暴露于IL-6（25 ng/ml）、IL-1β（20 ng/ml）和IL-23（20 ng/ml） 以FOXP3和HELIOS流式表达划分HELIOS+、FOXP3+HELIOS−和FOXP3−HELIOS−亚群 TSDR（FOXP3 CNS2）焦磷酸测序评估DNA去甲基化 CRISPR–Cas9 RNP电穿孔切除OCRprox、OCRdist或其片段，以AAVS1为对照 NSG小鼠经1.75 Gy照射后眶后静脉注射4×10^6 PBMC与4×10^6 Treg细胞（1:1）
摘要
小鼠调节性T（Treg）细胞可失去谱系身份并获得促炎功能，但人Treg细胞是否同样易受细胞因子驱动的失稳影响仍不清楚。本文建立了一个人Treg细胞失稳的体外模型，其特征为谱系决定转录因子FOXP3的沉默、抑制功能的丧失以及促炎活性的获得。单细胞染色质可及性和转录组分析揭示了全基因组范围内AP-1结合位点可及性增加，包括IRF4远端的一个推定调控元件。该元件可及性的增加与Treg细胞失稳过程中IRF4表达的升高相关，而其切除赋予了对炎症细胞因子诱导重编程的抗性。相反，IRF4与BATF的强制表达促进了Treg细胞失稳。这些数据确定了远端IRF4调控元件是一个关键节点，使增强的AP-1-IRF4协同活性得以驱动Treg细胞失稳，这对设计更稳定、更有效的基于Treg细胞的疗法具有意义。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 人Treg细胞是否易受炎症细胞因子驱动的失稳影响，其分子机制是什么。
- 核心机制
- 炎症细胞因子诱导AP-1上调并增加IRF4远端调控元件OCRdist的可及性，促进IRF4表达；IRF4与AP-1（BATF）协同形成前馈机制，维持高IRF4表达并驱动Treg细胞谱系失稳。
- 主要证据
- 体外反复CD3/CD28刺激联合IL-6/IL-1β/IL-23诱导FOXP3和HELIOS沉默、TSDR部分再甲基化、抑制功能下降和促炎因子产生；单细胞多组学显示AP-1位点可及性增加及IRF4 OCRdist可及性升高；CRISPR切除OCRdist减少FOXP3−HELIOS−细胞约85%并保留抑制功能；IRF4与BATF双过表达部分重现失稳；ΔOCRdist Treg在异种GvHD模型中延长小鼠生存。
- 研究意义
- 确定远端IRF4调控元件为调控人Treg细胞稳定性的关键节点，提示基因编辑破坏该元件可作为设计更安全、更有效过继Treg细胞疗法的策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证失稳Treg细胞的表观遗传与功能改变
判断FOXP3/HELIOS丢失是否反映Treg细胞命运的表观遗传改变及功能缺陷。
FACS纯化HELIOS+、FOXP3+HELIOS−和FOXP3−HELIOS−亚群，焦磷酸测序检测TSDR去甲基化；体外抑制实验检测对CD4+和CD8+ T细胞增殖的抑制；流式检测促炎因子产生。
单细胞多组学解析失稳分子特征
揭示Treg细胞失稳过程中的转录和染色质可及性特征。
对IL-6/IL-1β/IL-23暴露第16和25天的Treg细胞及对照Tconv细胞进行单细胞ATAC+基因表达多组学测序，WNN UMAP聚类并分析差异OCR和TF基序富集。
鉴定IRF4远端调控元件
确定IRF4位点上与Treg细胞失稳相关的调控区域。
分析IRF4位点OCRprox（内含子6）和OCRdist（TSS下游+40 kb）的染色质可及性及与IRF4表达的关联；用bulk ATAC-seq比较各细胞因子单独或联合处理的效果。
CRISPR切除OCR验证功能必要性
验证OCRprox和OCRdist对IRF4表达及Treg细胞失稳的作用。
用配对sgRNA和Cas9 RNP电穿孔切除OCRprox、OCRdist或其片段1/片段2，以AAVS1为对照，随后在炎症细胞因子下反复刺激，流式检测FOXP3、HELIOS、IRF4及表型标志。
CRISPRa过表达验证IRF4与BATF协同作用
验证IRF4与AP-1成员BATF共同驱动Treg细胞失稳。
用含CRISPRa元件的慢病毒和靶向IRF4和/或BATF的sgRNA转导Treg细胞，FACS纯化双阳性细胞，在无炎症细胞因子条件下反复刺激，检测HELIOS+细胞比例。
体内验证ΔOCRdist Treg细胞功能
评估OCRdist缺失是否在体内增强Treg细胞对炎症诱导失稳的抗性。
AAVS1或ΔOCRdist编辑的Treg细胞在含或不含IL-6/IL-1β/IL-23条件下扩增16天，与供者匹配PBMC按1:1共注射入预照射NSG小鼠，监测体重和GvHD生存。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达与表观遗传变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | CD3/CD28 Dynabeads | Thermo Fisher Scientific | -- |
| CD3/CD28/CD2 Immunocult | Stemcell Technologies | -- | |
| RPMI-1640培养基 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| MEM非必需氨基酸 | Gibco | -- | |
| HEPES | Gibco | -- | |
| 重组人IL-2 | Roche | -- | |
| 重组人IL-6 | Peprotech | -- | |
| 重组人IL-1β | Peprotech | -- | |
| 重组人IL-23 | Peprotech | -- | |
| 重组人IL-12 | Peprotech | -- | |
| 重组人IL-4 | Peprotech | -- | |
| 细胞分选 | EasySep人CD4+ T细胞富集试剂盒 | Stemcell Technologies | -- |
| FACSAria II流式细胞分选仪 | Becton Dickinson | -- | |
| FACSAria III流式细胞分选仪 | Becton Dickinson | -- | |
| 基因组编辑 | Cas9-NLS蛋白 | UC Berkeley QB3 Macrolab | -- |
| Nucleofector 4D电转仪 | Lonza | -- | |
| 慢病毒生产 | Lenti-X HEK293T细胞 | Takara | 632180 |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| 慢病毒浓缩 | Lenti-X浓缩试剂 | Takara | -- |
| 流式分析 | Foxp3转录因子染色缓冲液套装 | eBioscience | -- |
| 佛波酯 | Abcam | -- | |
| 离子霉素 | Sigma | -- | |
| 布雷菲德菌素A | ThermoFisher | -- | |
| Fortessa流式细胞仪 | Becton Dickinson | -- | |
| Aurora光谱流式细胞仪 | Cytek | -- | |
| 体外抑制实验 | CellTraceViolet细胞增殖染料 | ThermoFisher | -- |
| 抗CD3抗体（克隆Hit3a） | BD Biosciences | -- | |
| 抗CD28抗体（克隆28.2） | Biolegend | -- | |
| 可固定Live/Dead活力染料eFluor780 | ThermoFisher | -- | |
| 单细胞多组学测序 | Chromium Next GEM单细胞多组学ATAC+基因表达试剂盒 | 10x Genomics | -- |
| NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- | |
| TSDR甲基化分析 | FOXP3 TSDR焦磷酸测序检测 | EpigenDx | ADS783-FS2 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 人Treg细胞失稳体外模型 | 细胞因子浓度（IL-6 25 ng/ml、IL-1β 20 ng/ml、IL-23 20 ng/ml）、刺激周期（每9天）及检测时间点（第7、16、25天） 阅读提示：Methods“Human T cell culture”及Fig. 1a图注 |
| CRISPR–Cas9切除OCR | sgRNA序列、RNP浓度（20 μM）、电穿孔程序（EO-115）及电穿孔时间（刺激后64小时） 阅读提示：Methods“Genome editing”及Extended Data Fig. 6 |
| CRISPRa过表达 | sgRNA序列、慢病毒转导比例（CRISPRa-mCherry 3% v/v，sgRNA-GFP 1.5% v/v）及检测时间点（第38天） 阅读提示：Methods“CRISPRa overexpression”和“Lentivirus production and transduction”及Fig. 7c–e图注 |
| 异种GvHD小鼠模型 | 照射剂量（1.75 Gy）、细胞注射数量（4×10^6 PBMC与4×10^6 Treg细胞）、注射途径（眶后静脉）及小鼠品系（NSG） 阅读提示：Methods“Xenogeneic GvHD mouse model”及Fig. 8b,c图注 |
| TSDR甲基化分析 | 分选亚群（HELIOS+、FOXP3+HELIOS−、FOXP3−HELIOS−）及检测方法（焦磷酸测序，EpigenDX assay #ADS783-FS2） 阅读提示：Methods“TSDR methylation analysis”及Fig. 1d图注 |