前病毒序列景观与免疫遗传关联分析
确定HLA class I位点遗传变异与HIV-1储存库大小的关联
对104名长期ART感染者PBMC进行单基因组近全长前病毒测序，结合高分辨率HLA class I和KIR分型，比较不同等位基因携带者的完整和缺陷前病毒频率
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固有免疫印记塑造长期抗逆转录病毒治疗期间HIV-1储存库细胞的持续存在
Innate immune imprints shape HIV-1 reservoir cell persistence during long-term antiretroviral therapy
实验完整度
高包含104人队列前病毒测序、免疫遗传关联、NK细胞表型功能、单细胞线粒体追踪及体外功能验证等多层证据
主要模型
104名长期接受ART的HIV-1感染者PBMC样本 4,007名未治疗HIV-1感染者队列（病毒载量分析） HIV阴性CMV阳性/阴性参考队列PBMC HIV-1 NL4-3及含WITO Vpu序列的嵌合病毒体外感染原代CD4+ T细胞与自体NK细胞共培养
重点核对
104名长期ART感染者中位治疗21年（范围10–27年），PBMC采集后行单基因组近全长前病毒测序 HLA-C2、HLA-B Bw4及HLA-B*57/*27/*35Px等位基因与完整前病毒频率的线性回归关联分析（校正种族和HLA-B等位基因） 22标志物光谱流式分析KIR2DL1+KIR3DL1−NKG2C+ NK细胞比例与完整前病毒频率的Spearman相关性 HLA-E限制性HIV-1表位变异（E460A、R747P、Y79F等）与完整前病毒频率及NKG2C+ NK细胞比例的关联 自体CD4+ T细胞感染NL4-3构建体后与NK细胞按1:1效靶比共培养6小时检测IFN-γ
摘要
在抑制性抗逆转录病毒治疗期间，能够靶向并清除HIV-1储存库细胞的宿主免疫反应尚不清楚。本文通过分析104名接受长期抗逆转录病毒治疗个体的超过6,000个前病毒DNA扩增子，发现通过KIR2DL1相互作用促进NK细胞教育的HLA-C2同种异型携带者表现出较低频率的完整前病毒。在未治疗感染期间未观察到HLA-C2等位基因的保护效应，提示储存库细胞在抗逆转录病毒治疗下对NK细胞介导的免疫活性具有选择性易感性。支持这一点的是，KIR2DL1+ NK细胞的频率，特别是那些共表达活化性HLA-E受体NKG2C的细胞，与完整前病毒的频率呈负相关。此外，强烈下调HLA-C、增加KIR2DL1+ NK细胞缺失自我反应的病毒蛋白U变异体，在HLA-C2携带者中与较小的储存库相关。长期存活的感染细胞显示HLA-C表达升高，与体内选择抵抗KIR2DL1+ NK细胞介导的免疫清除一致。NKG2C–HLA-E相互作用增强了KIR2DL1+ NK细胞针对病毒储存库细胞的免疫活性，因为HLA-E限制性HIV-1表位的序列变异降低了NKG2C依赖性NK细胞活化，并与较高频率的完整前病毒相关。这些发现强调了宿主和病毒遗传变异对储存库持续存在的关键影响，并突出了在HIV治愈策略中利用固有免疫的机会。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 在长期抑制性抗逆转录病毒治疗期间，哪些宿主免疫反应能够靶向并塑造HIV-1储存库细胞池？
- 核心机制
- 通过KIR2DL1–HLA-C2教育并经NKG2C–HLA-E活化的NK细胞对低HLA-C表达的储存库细胞施加缺失自我免疫选择压力；Vpu介导的HLA-C下调增强该识别，而HLA-E限制性表位变异削弱NKG2C活化，存活细胞通过升高HLA-C表达逃逸清除。
- 主要证据
- 104名长期ART感染者6,077个前病毒扩增子测序显示HLA-C2携带者完整前病毒频率降低；KIR2DL1+KIR3DL1−NKG2C+ NK细胞频率与完整前病毒频率负相关；HLA-E表位变异与较高完整前病毒频率相关；单细胞 proteogenomic 追踪显示HLA-C2携带者长期ART后完整前病毒细胞HLA-C表达升高。
- 研究意义
- 挑战储存库细胞对免疫系统不可见的传统观点，强调宿主和病毒遗传变异对储存库持续存在的影响，并提示在HIV治愈策略中利用固有免疫的可能性。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
未治疗感染者病毒载量对照分析
判断HLA-C2/BBw4关联是否反映ART前已建立的免疫效应
在4,007名未接受ART的HIV-1感染者中分析HLA-C2和BBw4与血浆病毒载量的关系
HIV-1特异性CD8+ T细胞反应评估
排除HLA-C2/BBw4相关储存库差异由HIV-1特异性T细胞反应介导
用HIV-1 Gag肽池和CMV pp65/IE-1肽池刺激PBMC，检测CD8+ T细胞分泌IFN-γ、TNF、IL-2及CD107a/b、穿孔素、颗粒酶A/B
NK细胞深度表型分析
确定与HLA-C2/BBw4相关的NK细胞亚群及其与储存库大小的关系
用22个NK细胞表面标志物的光谱流式分析PBMC中NK细胞亚群，包括KIR2DL1、KIR3DL1、NKG2C、NKG2A、DNAM-1、CD57、KLRG1等
NK细胞克隆性追踪
评估KIR2DL1+KIR3DL1−NKG2C+ NK细胞是否发生克隆扩增
对HLA-C2表达ART感染者分选NK细胞，用寡核苷酸标记抗体染色后单细胞微流控封装，扩增近全长16 kb线粒体基因组和抗体标签，通过mtDNA变异推断克隆谱系
HLA-E限制性HIV-1表位变异分析
探究HLA-E限制性表位序列变异是否通过NKG2C影响储存库大小
在近全长前病毒序列中分析HLA-E限制性HIV-1表位氨基酸多样性，并与完整前病毒频率和KIR2DL1+NKG2C+ NK细胞比例关联
HLA-E稳定性和肽结合实验
验证HLA-E限制性表位变异对HLA-E表面稳定性和肽结合的影响
用HLA-E转染的K562细胞和TAP缺陷RMA-S细胞进行肽脉冲HLA-E稳定化实验，并用ELISA检测肽与HLA-E–β2M复合物结合
NK细胞功能验证实验
验证HLA-E表位变异和Vpu介导HLA-C下调对NKG2C依赖性NK细胞活化的影响
构建含野生型或变异型HLA-E限制性Gag表位及功能性或非功能性Vpu的NL4-3病毒，感染自体CD4+ T细胞后与NK细胞共培养，检测IFN-γ分泌
Vpu序列变异与储存库关联分析
评估Vpu介导HLA-C下调能力与体内储存库大小的关系
分析近全长前病毒Vpu序列第2、3、5、15、16、24位氨基酸与完整前病毒频率的关系，并与HLA-E表位变异进行联合分析
单细胞proteogenomic追踪HIV-1储存库细胞HLA-C表达
验证HLA-C2携带者中长期ART后完整前病毒细胞HLA-C表面表达是否升高
用PheP-Seq对HLA-C1或HLA-C2纯合感染者ART约1年和17–20年的记忆CD4+ T细胞进行单细胞表面蛋白和18个HIV-1基因组区域扩增子测序
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| CMV血清学检测 | Arlington Scientific巨细胞病毒IgG ELISA检测试剂盒 | Arlington Scientific | 22-415-207 |
| Abbexa巨细胞病毒IgG快速检测试剂盒 | Abbexa | ABIN5708603 | |
| NK细胞流式分析 | LIVE/DEAD Blue活性染料 | Invitrogen | -- |
| Fc受体阻断试剂 | Miltenyi Biotec | -- | |
| Aurora光谱流式细胞仪 | Cytek Biosciences | -- | |
| T细胞功能分析 | HIV-1共识B亚型Gag肽池 | NIH AIDS Reagent Program | ARP-12425 |
| Peptivator CMV pp65肽 | Miltenyi Biotec | 130-093-435 | |
| Peptivator CMV IE-1肽 | Miltenyi Biotec | 130-093-493 | |
| 抗CD28抗体 | BD Biosciences | -- | |
| 抗CD49d抗体 | BD Biosciences | -- | |
| 抗CD107a抗体（克隆H4A3） | BioLegend | -- | |
| 抗CD107b抗体（克隆H4B4） | BioLegend | -- | |
| 布雷菲德菌素A | BioLegend | -- | |
| 莫能霉素 | BD Biosciences | -- | |
| FoxP3转录因子缓冲液试剂盒 | eBioscience | -- | |
| HLA-E稳定化实验 | BV421标记抗HLA-E抗体（克隆3D12） | BioLegend | -- |
| Opti-MEM I减血清培养基 | -- | -- | |
| ELISA-based HLA-E结合实验 | 抗HLA-E单克隆抗体（克隆3D12） | BioLegend | -- |
| HRP标记兔抗人β2M抗体 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| EnVision+ System-HRP | Agilent | -- | |
| 病毒构建 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Lenti-X p24快速滴度试剂盒 | Takara | 631476 | |
| NK细胞功能实验 | ImmunoCult人CD3/CD28 T细胞激活剂 | Stemcell | 10971 |
| CD4+ T细胞阴性免疫磁珠富集试剂盒 | Miltenyi Biotec | -- | |
| CD4阳性免疫磁珠选择试剂盒 | Stemcell | 17852 | |
| NK细胞免疫磁珠富集试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-092-657 | |
| 重组人IL-15 | -- | -- | |
| 重组IL-2 | -- | -- | |
| HLA-C表达流式检测 | FITC标记抗HIV核心抗原KC57抗体 | Beckman Coulter | 6604665 |
| 单细胞蛋白基因组分析 | Human TruStain FcX | BioLegend | 422301 |
| 小鼠IgG对照抗体 | BioLegend | 400299 | |
| 小鼠IgG对照抗体 | BioLegend | 400383 | |
| Flowmi 40微米细胞滤网 | Thermo Fisher Scientific | 14-100-150 | |
| Tapestri分析平台 | Mission Bio | -- | |
| AMPure XP磁珠 | Beckman Coulter | A63882 | |
| 高灵敏度D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
| Agilent 4200 TapeStation系统 | Agilent Technologies | -- | |
| Qubit 4.0荧光计 | Invitrogen | -- | |
| PhiX对照DNA | Illumina | FC-110-3002 | |
| NextSeq 2000 P3试剂（300循环） | Illumina | 20040561 | |
| NextSeq2000测序仪 | Illumina | -- | |
| NovaSeq X Plus测序仪 | Illumina | -- | |
| 记忆CD4+ T细胞阴性免疫磁珠富集试剂盒 | Stemcell | 19157 | |
| HLA-E抗体（克隆3D12） | BioLegend | -- | |
| HLA-C抗体（克隆DT-9） | BioLegend | -- | |
| HLA-G抗体（克隆87G） | BioLegend | -- | |
| HLA-A,B,C抗体（克隆W6/32） | BioLegend | -- | |
| CD4抗体（克隆RPA-T4） | BioLegend | -- | |
| CD3抗体（克隆UCHT1） | BioLegend | -- | |
| CCR7抗体（克隆G043H7） | BioLegend | -- | |
| CD45RA抗体（克隆HI100） | BioLegend | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 前病毒测序与HLA/KIR分型队列 | n=104名长期ART感染者中位治疗21年（范围10–27年）；仅单扩增子PCR序列用于储存库定量；克隆性完整前病毒仅计数一次 阅读提示：Methods“Study participants”和“Near full-length proviral sequencing”；Supplementary Table 1 |
| HLA-C2/BBw4与储存库关联的回归模型 | 校正变量包括种族和HLA-B*57/*27/*35Px；结局为总前病毒、完整前病毒、unique完整前病毒和缺陷前病毒 阅读提示：Table 1；Extended Data Fig. 2c；Methods“Statistics” |
| NK细胞流式表型分析 | 22个NK细胞表面标志物组合；荧光减一设门对照；CMV血清状态（98%以上阳性）；KIR2DL1抗体克隆HP-DM1特异性验证 阅读提示：Methods“Phenotypic analysis of NK cells by flow cytometry”；Supplementary Table 4；Extended Data Fig. 10 |
| HLA-E限制性表位变异关联分析 | n=102名可检测近全长前病毒者；Vpu分析n=99名有完整Vpu序列者；表位变异与HLA-C2交互项 阅读提示：Fig. 4a–c；Extended Data Fig. 6；Methods“Near full-length proviral sequencing” |
| NK细胞功能验证共培养 | MOI 0.1感染6小时；效靶比1:1共培养6小时；n=6名HLA-C2+CMV+供者；Vpu为WITO来源功能序列或NL4-3非功能序列 阅读提示：Methods“Functional NK cell assays”和“Viral constructs”；Fig. 4e |
| 单细胞proteogenomic追踪 | HLA-C1纯合2名和HLA-C2纯合2名；ART约1年和17–20年样本；18个HIV-1基因组区域扩增；分析细胞数310,438和345,635 阅读提示：Methods“Single-cell proteogenomic profiling of CD4+ T cells”；Fig. 5e–f |